陸培培，郭彩霞，馬 杰，梁曉鵬，閆思雨，周憲梁，馬麗紅

心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)是全球最常見的死亡原因，已對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)是最常見的心血管疾病，其患病率約占心血管疾病的25%。2015年研究數(shù)據(jù)表明，全球高達(dá)900萬人死于IHD，使其成為致死率最高的疾病[2]。最新數(shù)據(jù)顯示，IHD在高收入國家患病率呈下降趨勢[3]，但在我國由于人口老齡化及城鎮(zhèn)化進(jìn)程的加速和心血管病危險(xiǎn)因素的流行，IHD患病率迅速增長，已躍居我國居民死亡原因的首位[4]。因此，尋找治療IHD的新藥物，降低其死亡率，具有重要的臨床意義。

細(xì)胞自噬是存在于真核生物細(xì)胞中的一種自我降解異常蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的生命活動(dòng)，在細(xì)胞生存、分化和穩(wěn)態(tài)維持中起到重要作用[5]。大量研究證實(shí)，細(xì)胞自噬參與調(diào)節(jié)缺血性心臟病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后過程[1，6-7]，并與細(xì)胞凋亡途徑關(guān)系密切[8-9]。當(dāng)心肌缺血時(shí)，心肌損傷的形式包括細(xì)胞凋亡、壞死和新近提出的自噬相關(guān)性細(xì)胞死亡[9]。故減少心肌細(xì)胞凋亡能保護(hù)缺血性心肌損傷，延緩甚至阻斷缺血后心力衰竭的發(fā)生。心復(fù)力顆粒(Xinfuli granules，XG)是施今墨傳人丁鳴九先生創(chuàng)制的用于治療心力衰竭的經(jīng)驗(yàn)方改良制劑。前期研究發(fā)現(xiàn)該藥能夠抑制心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡[10]，改善能量代謝[11]，抑制心肌梗死后心肌纖維化和心室重構(gòu)[12]，但目前對(duì)其抑制心肌細(xì)胞凋亡和纖維化的機(jī)制仍不清楚，研究表明誘導(dǎo)缺血心肌細(xì)胞自噬可抑制凋亡，改善心功能[13-14]。因此，本研究擬采用缺氧無血清 (hypoxia/serum-deprivation，H/SD)條件培養(yǎng)大鼠H9C2心肌細(xì)胞，體外模擬心肌缺血，探討心復(fù)力顆粒對(duì)缺血心肌細(xì)胞凋亡和自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株 大鼠心肌細(xì)胞H9C2購自上海拜力生物技術(shù)有限公司(ATCC)。

1.1.2 心復(fù)力顆粒溶液制備 心復(fù)力顆粒為我院內(nèi)部制劑，由黃芪、人參、丹參、白芍、桂枝等組成，用水煎煮、真空濃縮、噴霧干燥、干式制粒，每包 5 g，含生藥量18.1 g。將上述顆粒溶于DMEM培養(yǎng)基后置于60 ℃水浴鍋中，超聲震蕩溶解，以3 000 r/min離心10 min后，再以孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，沉渣烘干用以計(jì)算藥物溶液濃度，DMEM培養(yǎng)基定容至濃度為2 mg/mL，分裝后于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗及胎牛血清購自美國Gibco公司；細(xì)胞缺氧培養(yǎng)盒、厭氧發(fā)生袋、厭氧指示條均購自Mitsubishi Gas Chemical 公司；Western blotting 檢測中所用的一抗均購自CST公司，二抗購自中杉金橋公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將H9C2心肌細(xì)胞在含有10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 mg/L鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，放置在 37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，1～2 d 更換1次培養(yǎng)基，2～3 d 傳代1次。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 ①藥物濃度梯度實(shí)驗(yàn)：確定心復(fù)力顆粒保護(hù)心肌細(xì)胞的最適濃度，分為6組，分別為正常組(Normal)、缺氧無血清組(H/SD)、XG 100組(XG 100 μg/mL)、XG 200組(XG 200 μg/mL)、XG 400組(XG 400 μg/mL)、XG 800組(XG 800 μg/mL)。 ②抑制劑實(shí)驗(yàn)：分為5組，分別為正常組(Normal)、缺氧無血清組(H/SD)、XG組(XG 400 μg/mL)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)組(3-MA 5 μmol/L)、XG+3-MA組(XG 400 μg/mL+3-MA 5 μmol/L)。

1.2.3 體外缺氧模型的建立 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1.0×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗2次，加入適量DMEM無血清培養(yǎng)基，并按上述分組加入相應(yīng)濃度的藥物處理。將細(xì)胞置于含厭氧指示條的缺氧盒中，放入?yún)捬醮杆訇P(guān)閉缺氧盒。將缺氧盒放在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 Hoechst 33342熒光染色檢測細(xì)胞凋亡 取經(jīng)過相應(yīng)處理后的細(xì)胞，用4%的多聚甲醛在室溫下固定10 min，PBS洗滌2次，6孔板中每孔加入1 mL Hoechst 33342染液，室溫避光反應(yīng)30 min。棄去染液，PBS洗滌2次后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)并拍照。

1.2.5 MDC染色檢測細(xì)胞自噬 取經(jīng)過相應(yīng)處理后的細(xì)胞，在培養(yǎng)基中加入100 μmol/L單丹磺酰尸胺(MDC)染液，室溫避光反應(yīng)30 min。棄去染液，PBS洗滌2次后加入適量含血清的培養(yǎng)基在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬顆粒并拍照。

1.2.6 Western blotting檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平 收取經(jīng)過相應(yīng)處理后的細(xì)胞，胞裂解液提取蛋白，蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA)法測定蛋白濃度。以每孔30 μg總蛋白量上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入相應(yīng)濃度的一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后用相應(yīng)的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗孵育1 h，洗膜后曝光、顯影、定影。目的蛋白含量以β-actin作為內(nèi)參，通過Quantity One軟件定量分析目的蛋白條帶。

2 結(jié) 果

2.1 心復(fù)力顆粒抑制缺氧無血清條件下H9C2細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)處理后，通過Hoechst 33342形態(tài)學(xué)和凋亡蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3檢測細(xì)胞凋亡。在倒置相差熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，缺氧無血清組細(xì)胞形態(tài)明顯皺縮，大量細(xì)胞漂浮，貼壁細(xì)胞減少，而經(jīng)過心復(fù)力顆粒處理的各組細(xì)胞皺縮及漂浮細(xì)胞數(shù)量均減少，貼壁細(xì)胞在數(shù)量上接近正常組，且具有一定的濃度依賴性，在藥物濃度為400 μg/mL時(shí)保護(hù)作用最強(qiáng)。如圖1所示，正常組細(xì)胞核大而均勻，呈現(xiàn)淡藍(lán)色；缺氧無血清組細(xì)胞核明顯固縮、碎裂，形態(tài)不規(guī)則；而心復(fù)力顆粒各濃度組細(xì)胞核形態(tài)變化隨著濃度增加而逐漸接近正常組，在XG400組的細(xì)胞核形態(tài)最接近正常組。

同時(shí)Western blotting結(jié)果顯示，缺氧無血清條件明顯抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)。心復(fù)力顆粒處理后，可顯著性抑制細(xì)胞凋亡，Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax和Caspase-3的表達(dá)下調(diào)，且呈濃度依賴性，在XG400組作用最顯著，從而表明心復(fù)力顆粒可抑制缺氧無血清條件下H9C2 心肌細(xì)胞凋亡。詳見圖2。

注：箭頭指示凋亡細(xì)胞核。

注：內(nèi)參為β-actin，各組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。與Normal比較，*P<0.05,# P <0.01;與H/SD 比較,△P <0.01。

圖2 各組Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白的表達(dá)水平比較

2.2 心復(fù)力顆粒誘導(dǎo)H/SD條件下H9C2細(xì)胞自噬 MDC染色可顯示自噬過程中自噬小體的形成，是檢測細(xì)胞自噬的有效方法。如圖3所示，與正常組比較，缺氧無血清組自噬小體明顯減少，而在XG各濃度組中，隨著藥物濃度增加，自噬小體數(shù)量明顯增加，在XG400組最明顯。同時(shí)作為自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-β(microtubule associated protein 1 light chain 3β，LC3)蛋白表達(dá)水平與MDC染色結(jié)果基本一致，如圖3所示，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ呈劑量依賴性增加，并在XG 400組表達(dá)水平達(dá)到峰值。

注:與Normal 比較,*P <0.05;與H/SD 比較,# P <0.05,△ P <0.01。

2.3 心復(fù)力顆粒通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬而發(fā)揮抗凋亡作用 用自噬特異性抑制劑3-MA處理細(xì)胞后，與缺氧無血清組比較，細(xì)胞凋亡明顯增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著減少，而凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)呈上升趨勢。心復(fù)力顆粒400 μg/mL可削弱3-MA的促凋亡作用，上調(diào)Bcl-2和LC3的表達(dá)水平，下調(diào)Bax和Caspase-3的表達(dá)水平。結(jié)果表明心復(fù)力顆?？梢源龠M(jìn)H9C2心肌細(xì)胞自噬而起到抑制凋亡的作用。詳見圖4。

注:內(nèi)參為β-actin,各組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。與H/SD 組比較,*P <0.05,# P <0.01;與3-MA 比較,△ P <0.05,☆ P <0.01。

3 討 論

IHD是由冠狀動(dòng)脈血流和心肌之間供氧需求失衡而導(dǎo)致的心肌細(xì)胞缺氧，最終發(fā)生凋亡和壞死，引起心肌損傷。近年來大量研究證實(shí)細(xì)胞凋亡參與IHD過程，造成心肌細(xì)胞減少，心肌纖維化和心室重構(gòu)，最終發(fā)展為心力衰竭[15-16]，因此減少缺血心肌發(fā)生細(xì)胞凋亡可以延緩甚至阻斷心力衰竭的發(fā)生。細(xì)胞凋亡過程涉及一系列基因的激活、表達(dá)和調(diào)控，其中最主要的成員包括Bcl家族和Caspase家族，其中Bcl-2作為凋亡抑制因子，其過表達(dá)抑制凋亡，Bax和Caspase-3作為凋亡促進(jìn)因子，其過表達(dá)促進(jìn)凋亡的發(fā)生[17-19]。

細(xì)胞自噬自20世紀(jì)50年代首次報(bào)道后，近20年來引起科學(xué)界的廣泛關(guān)注，其既存在于機(jī)體的生理過程中，又參與多種病理生理過程，如腫瘤、神經(jīng)退行性病變以及衰老[5]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬在IHD的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，多數(shù)證據(jù)支持，細(xì)胞自噬在IHD中作為一種保護(hù)性機(jī)制發(fā)揮心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，可能成為臨床治療IHD的新靶點(diǎn)[20]。Foglio等[13]研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死后心肌梗死區(qū)細(xì)胞自噬增強(qiáng)伴隨凋亡率減少，Bax/Bcl-2比值和Caspase-3活性下降。Zhong 等[21]研究表明誘導(dǎo)自噬可減少缺氧/再灌注條件下心肌細(xì)胞的凋亡，提高存活率，當(dāng)用自噬抑制劑氯喹阻斷自噬后，該心肌保護(hù)作用也消失。但有研究發(fā)現(xiàn)在心肌缺氧/再灌注過程中，細(xì)胞自噬扮演著雙重角色，缺血期自噬增強(qiáng)促進(jìn)心肌細(xì)胞存活，而當(dāng)血流恢復(fù)后誘導(dǎo)自噬對(duì)心肌有損傷作用[22]。為了驗(yàn)證自噬在缺氧心肌中的作用，本研究選用H9C2心肌細(xì)胞在缺氧無血清條件下培養(yǎng)用以模擬體內(nèi)缺血環(huán)境，以驗(yàn)證心復(fù)力顆粒對(duì)細(xì)胞凋亡和自噬的影響。

心復(fù)力顆粒由黃芪、人參、丹參、白芍、桂枝、葶藶子等組成，具有益氣溫陽、活血利水的功效。該復(fù)方在臨床應(yīng)用50余年，在治療缺血后心力衰竭方面療效顯著。本課題組前期研究證實(shí)，心復(fù)力顆粒可改善異丙腎上腺素引起的大鼠心肌梗死和心室重構(gòu)[23]，減輕心肌梗死后心肌纖維化[12]，保護(hù)缺血后心肌損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，與缺氧無血清組比較，心復(fù)力顆粒各組心肌細(xì)胞凋亡水平顯著下降，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)上調(diào)，促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)下降，同時(shí)，細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)明顯增強(qiáng)，且在心復(fù)力顆粒400 μg/mL時(shí)自噬水平達(dá)到高峰。采用自噬特異性抑制劑3-MA后，細(xì)胞凋亡增加，但該作用可被心復(fù)力顆粒削弱，表明心復(fù)力顆粒是通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)揮抗凋亡作用。

本研究從細(xì)胞層面初步探討了心復(fù)力顆粒在缺血性心臟病發(fā)病機(jī)制中的抗凋亡作用與自噬的保護(hù)作用，并在缺氧無血清培養(yǎng)條件下的H9C2心肌細(xì)胞中證實(shí)心復(fù)力顆粒通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)揮抗凋亡作用，從而起到保護(hù)心肌的作用。