李晗宇，陳 飛

卵巢癌是全世界女性中發(fā)病率較高且死亡率最高的一類婦科腫瘤性疾病，也是女性惡性腫瘤中相關(guān)死亡率最常見的原因[1]。盡管目前手術(shù)和化療治療方式都取得了一定的進展，但卵巢癌患者的總體存活率仍然很低[2]。最近的研究表明，許多長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在多種細胞過程中都具有重要作用，如增殖，分化，凋亡，細胞生物行為以及疾病發(fā)病機制，導(dǎo)致對細胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響，干擾其進程[3]。LncRNA DRAIC是一種廣泛表達的lncRNA，首次被發(fā)現(xiàn)是非小細胞肺癌中高轉(zhuǎn)移潛能和預(yù)后不良的因子[4]。最近，lncRNA DRAIC與多種人類腫瘤相關(guān)，包括肺癌、肝癌、腎癌、結(jié)直腸癌、胃癌和乳腺癌[5]。生物信息學(xué)分析表明lncRNA DRAIC與miR-181(一種有效的腫瘤抑制因子)結(jié)合，然后靶向miR-181的表達[6]。本研究探討lncRNA DRAIC調(diào)控miR-181通過STAT信號通路對卵巢癌遷移和侵襲的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞株 人卵巢癌細胞株SKOV3、COC1、CAOV3和A2780購買于中國科學(xué)院上海分院。卵巢癌細胞株均培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，所有細胞均在5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)，每隔3 d換液1次，待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底進行傳代，以下所有試驗均取處于對數(shù)生長期的細胞。

1.2 材料和試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基和0.25胰酶(0.25 Trypsin EDTA)購買于美國Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和雙抗(Penicillin-Streptomycin Solution)購買于美國?？寺」荆籔BS磷酸鹽緩沖液購買于中國碧云天生物公司。DRAIC-siRNA購買于上海吉瑪有限公司。氯仿、乙醇、異丙醇購買于重慶川東化工公司。Trizol裂解液、Premix ExTaqVersion2.0和SYBR Premix Ex Taq購買于日本Takara公司。PCR引物由上海Sangon Biotech公司合成。Transwell基質(zhì)膠購買于美國BD公司；Transwell小室購買于美國康寧公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞轉(zhuǎn)染 PBS緩沖液將細胞清洗干凈，胰酶消化細胞2 min，轉(zhuǎn)移至無菌15 mL離心管，離心并計數(shù)細胞，以每孔4×105個細胞接種于96孔板中，掌握過夜細胞融合率達70%左右，細胞分為DRAIC-siRNA組和NC組2組，無血清培養(yǎng)基將Lipofectamine 2000按3 μL/L進行稀釋，37 ℃孵育20 min，用無血清培養(yǎng)基分別將DRAIC-siRNA和NC按50 μM濃度稀釋，常溫下孵育5 min，最后與Lipofectamine 2000等體積分別混勻，分別加入2組細胞中，37 ℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)；12 h后，觀察轉(zhuǎn)染細胞狀態(tài)，并將無血清培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，48h后，提取細胞RNA，驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.3.2 實時熒光定量PCR分析 提取卵巢癌細胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)cDNA。DRAIC上游引物序列為：5′-ATCTTTAGCTGGAGTTCGA-3′，下游引物序列為：5′-AAGGCTTGAGGGCGAGCGAT-3′;miR-181上游引物序列為：5′-ATCGTAGGTCGAGCGGAGC-3′，下游引物序列為：5′-GGGATGCGATTTGCGAGCT-3′。內(nèi)參照GAPDH的上游引物的序列為5′-TTGGTATCGTGGAAGGACTCA-3′，下游引物序列為5′-TGTCATCATATTTGGCAG-GTT-3′。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃15 s，60 ℃15 s，45個循環(huán)，獲取熒光信號溫度為60 ℃。普通cDNA實時熒光定量PCR檢測，采用2-△△Ct方法進行統(tǒng)計。

1.3.3 平板克隆細胞實驗 首先消化并計數(shù)細胞，以5 000/孔細胞數(shù)接種于96孔板中，每組3個復(fù)孔，37 ℃孵箱培養(yǎng)；待細胞貼壁，觀察細胞狀態(tài)，吸出培養(yǎng)基，避光條件下，分別加入不同慢病毒轉(zhuǎn)染的細胞中，37 ℃孵育24 h；檢測不同組細胞的克隆形成數(shù)目，并統(tǒng)計分析。

1.3.4 Transwell侵襲實驗 將5×104個細胞置于上室，并加入Matrigel基質(zhì)膠。將具有10%FBS(20 ng/mL)的培養(yǎng)基置于下室中。在37 ℃下孵育24 h后，小心地去除上膜表面上的細胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結(jié)晶紫溶液染色10 min，自來水沖洗干凈過后，于倒置顯微鏡下計數(shù)。

1.3.5 熒光素酶報告基因測定 根據(jù)Clément等[7]研究方法，構(gòu)建含DRAIC基因野生型3′UTR、突變型3′UTR片段，兩端均設(shè)計XbaⅠ酶切位點，插入熒光素酶報告基因質(zhì)粒(pGL3-promoter，Promega)構(gòu)建pGL3-3′UTR WT、pGL3-3′UTR MUT。取生長狀態(tài)良好的293T細胞，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h據(jù)Promega公司操作說明，裂解細胞，加入熒光素酶底物，檢測熒光素酶活性。

1.3.6 裸鼠體內(nèi)成瘤實驗 取10只4～6周齡裸鼠，分為DRAIC-siRNA組和NC組，每組5只。將1×106濃度的轉(zhuǎn)染NC序列和DRAIC-siRNA的卵巢細胞分別注射到2組裸鼠的左側(cè)腋下。飼養(yǎng)8周后檢測裸鼠腫瘤異種移植物的體積和質(zhì)量生長情況。異體移植物大小根據(jù)以下公式測量：體積=1/2(最短直徑)2×(最長直徑)。

1.3.7 Western Blot實驗 細胞分為NC組、DRAIC-siRNA組和miR-181-mimic組，從卵巢癌細胞SKOV3中提取總蛋白，將總蛋白的等分試樣行10% SDS-PAGE，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。分別使用抗JAK1、STAT2、p-JAK1、p-STAT2和GAPDH抗體進行孵育，4 ℃過夜，次日PBS洗滌后，加入Ⅱ抗，室溫孵育PBS充分洗滌后進行ECL顯影，拍照并統(tǒng)計相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA DRAIC和miR-181在卵巢癌細胞株中的表達情況 通過實時熒光定量PCR檢測lncRNA DRAIC在卵巢癌細胞株中的表達，結(jié)果顯示SKOV3中l(wèi)ncRNA DRAIC的表達(2.51±0.26)高于其他COC1(2.31±0.21)，CAOV3(1.03±0.13)和A2780(1.93±0.12)細胞株(P<0.05)，同時對miR-181在卵巢癌細胞株中的表達進行檢測，SKOV3中miR-181的表達(2.55±0.31)高于CAOV3(0.76±0.11)和A2780(1.62±0.13)細胞株(P<0.05)，稍低于COC1細胞株(2.72±0.24)。圖1。后續(xù)實驗選取卵巢癌SKOV3細胞株作為研究對象。

圖1 lncRNA DRAIC和miR-181在卵巢癌細胞株中的表達

2.2 雙熒光素酶實驗檢測lncRNA DRAIC和miR-181之間的關(guān)系 通過生物信息學(xué)檢測lncRNA DRAIC與miR-181之間的相互關(guān)系，結(jié)果顯示(圖2A)，lncRNA DRAIC和miR-181在卵巢癌細胞中可能有相似結(jié)合的位點，表明lncRNA DRAIC與miR-181之間可能有調(diào)控關(guān)系。通過使用DRAIC-siRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞后，miR-181-WT的表達水平明顯降低[(1.02±0.11)vs(0.38±0.05)，P<0.05]，而miR-181-MUT的表達水平變化不大[(1.02±0.11)vs(0.96±0.08)，P>0.05]，圖2B。

2.3 LncRNA DRAIC對卵巢癌細胞增殖行為的影響 通過平板克隆細胞實驗檢測lncRNA DRAIC對卵巢癌細胞株SKOV3增殖能力的影響。首先使用特異的干擾RNA(DRAIC-siRNA)抑制卵巢癌細胞中l(wèi)ncRNA DRAIC的表達，在轉(zhuǎn)染DRAIC-siRNA 48 h和60 h后，SOKV3細胞的增殖能力明顯低于對照組(*P<0.05，**P<0.01)，圖3。

2.4 LncRNA DRAIC對卵巢癌細胞侵襲行為的影響 Transwell實驗結(jié)果如圖4所示，抑制lncRNA DRAIC后，和NC組相比，DRAIC-siRNA組的侵襲細胞數(shù)目[(186.4±12.4) vs (73.6±8.6),P<0.05]顯著降低。

圖4 lncRNA DRAIC對卵巢癌細胞侵襲行為的影響

2.5 LncRNA DRAIC對卵巢癌細胞遷移行為的影響 劃痕愈合實驗結(jié)果如圖5所示，抑制lncRNA DRAIC后，和NC組相比，DRAIC-siRNA組的細胞遷移距離比例[(2.53±0.24) vs (1.21±0.09)，P<0.05]顯著降低。

圖5 lncRNA DRAIC對卵巢癌細胞遷移行為的影響

2.6 LncRNA DRAIC對卵巢癌細胞裸鼠成瘤能力的影響 通過裸鼠異種移植腫瘤生長測定，DRAIC-siRNA組平均腫瘤體積明顯小于NC組[(1.135±0.09)cm3vs (2.13±0.13)cm3,P<0.05]，而且DRAIC-siRNA組平均腫瘤重量也顯著低于對照組[(1.52±0.12)g vs (1.89±0.21)g,P<0.05]。圖6。

圖6 lncRNA DRAIC對卵巢癌細胞裸鼠成瘤能力的檢測

2.7 LncRNA對JAK1/STAT2信號通路激活的影響 Western Blot實驗結(jié)果顯示，與NC組相比，DRAIC-siRNA組的磷酸化p-JAK1和p-STAT2蛋白表達水平相應(yīng)下調(diào)，而同時過表達miR-181-mimic后，磷酸化p-JAK1和p-STAT2蛋白表達水平相應(yīng)的恢復(fù)，表明抑制DRAIC可以在一定程度上抑制JAK1/STAT2信號通路的激活，而同時增加miR-181的表達后對JAK1/STAT2的抑制效果相對緩解，同時非磷酸化的JAK1和STAT2蛋白表達未受明顯的影響。圖7。

圖7 lncRNA對JAK1/STAT2信號通路激活的影響

3 討論

LncRNA DRAIC可以以不同細胞類型特異性方式進行動態(tài)變化。在成年小鼠組織中，lncRNA DRAIC在有限的細胞類型中表達，例如消化組織的上皮層。相比之下，lncRNA DRAIC在人類更廣泛的細胞類型中表達[8]。最近研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA DRAIC的生物學(xué)作用主要與缺氧、病毒感染以及人胚胎干細胞分化有關(guān)[9]。據(jù)報道lncRNA DRAIC的水平在不同的癌癥類型中呈現(xiàn)動態(tài)調(diào)節(jié)。例如，血漿lncRNA DRAIC水平可作為非小細胞肺癌的探索指標(biāo)[10]；lncRNA DRAIC在結(jié)直腸癌中的表達上調(diào)，并與腫瘤的分化、浸潤、轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)[11]；此外，高表達lncRNA DRAIC是結(jié)直腸癌預(yù)后不良的獨立預(yù)后指標(biāo)[12]；lncRNA DRAIC還參與了肝細胞癌，慢性淋巴細胞白血病和前列腺癌的疾病進展[13]。然而，它在卵巢腫瘤發(fā)生中的作用尚未明確。

本研究證實lncRNA DRAIC是人類卵巢癌細胞的致癌調(diào)節(jié)劑，針對卵巢癌lncRNA DRAIC的治療靶點研究具有潛在應(yīng)用前景。本研究發(fā)現(xiàn)由lncRNA DRAIC介導(dǎo)的生物網(wǎng)絡(luò)對卵巢癌致癌作用貢獻很大，在這個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)中，上游lncRNA DRAIC影響轉(zhuǎn)錄miR-181，進而激活JAK1/STAT2信號通路，JAK1/STAT2在卵巢癌細胞樣本中參與程度沒有明顯差異，而磷酸化的JAK1/STAT2的表達水平受lncRNA DRAIC和miR-181影響明顯。本研究結(jié)果表明miR-181受lncRNA DRAIC的調(diào)控表達活性降低，抑制miR-181有助于調(diào)控JAK1/STAT2靶標(biāo)信號通路的激活，同時包括許多致癌基因的表達失調(diào)。本研究證實lncRNA DRAIC在卵巢癌細胞系中表達較高，這與之前相關(guān)研究的結(jié)果數(shù)據(jù)一致[14]。本研究結(jié)果表明lncRNA DRAIC可能在體外和體內(nèi)控制卵巢癌細胞生長中發(fā)揮作用。更重要的是，在體內(nèi)移植實驗中，lncRNA DRAIC水平的降低顯著地抑制了腫瘤生長。結(jié)果證實可能通過下調(diào)這種潛在的生物標(biāo)志物來提供有效抑制腫瘤的治療方法，這將為卵巢癌患者的臨床治療和預(yù)后提供更有效途徑。

本研究存在一定的不足，只在lncRNA DRAIC序列中鑒定了一個miR-181結(jié)合位點，但當(dāng)在不同條件下使用報告基因和內(nèi)源基因作為檢測源時，它顯示出明顯的熒光活性水平不同，目前已經(jīng)證明lncRNA DRAIC的作用位點和含有功能性miR-181的結(jié)合位點相近，但仍未證實通過生物信息學(xué)分析預(yù)測的更準確的結(jié)合位點，有必要進一步進行生物信息學(xué)分析以揭示可能具有強堿基對的miR-181的位點與目標(biāo)基因的結(jié)合。

綜上所述，我們的研究表明卵巢癌細胞中特異性lncRNA DRAIC作為一種miRNA分子的調(diào)節(jié)劑，可以調(diào)控miR-181以干擾卵巢癌的基因的表達并進一步保持卵巢癌細胞的生物學(xué)功能，為卵巢癌的分子診斷和治療提供了新的研究途徑和方向。