鄭志偉，朱輝德，方玫玫，蔡曉銳，朱志偉，陳 蕾

食管癌是潮汕地區(qū)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，調(diào)查研究顯示[1]，2003年汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院住院患者前10位的疾病譜中，食管癌在住院病種中排名第一，而且其構(gòu)成比比排名第二名的鼻咽癌高出7.9%，由此可見(jiàn)，食管癌仍較嚴(yán)重地威脅著當(dāng)?shù)鼐用裆眢w健康。如何早期檢查和發(fā)現(xiàn)食管癌患者，尋找食管癌的防治對(duì)策，成為困惑臨床的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。近年來(lái)血清中循環(huán)微小RNA(microRNA,miR)的研究逐步顯示其作為生物標(biāo)志物的潛能，外周血miRNAs可能是一種理想的腫瘤標(biāo)志物，因其取材方便，顯著的腫瘤相關(guān)性、組織特異性和表達(dá)穩(wěn)定性，可以應(yīng)用于食管癌的早期診斷、治療和預(yù)后的評(píng)估[2-3]。本研究選擇了miR-21作為目標(biāo)基因，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-21在食管鱗癌中的表達(dá)，結(jié)合患者臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，探索及分析miR-21作為食管鱗癌診斷及預(yù)后標(biāo)志物的潛力。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2016年10月—2017年6月汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院食管鱗癌患者50例和健康體檢者50例。食管鱗癌患者均由本院取病理組織活檢證實(shí)，其中男性38名，女性12名，年齡(57.28±8.42)歲。納入病例標(biāo)準(zhǔn)：①符合食管鱗癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②確診后在我院接受至少連續(xù)2次的輔助或新輔助化療，且化療前后已進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查；③有相關(guān)的影像學(xué)、內(nèi)鏡資料可進(jìn)行腫瘤分期確定。正常對(duì)照組為50名性別、年齡相匹配的在本院健康體檢中心進(jìn)行體檢的人員，對(duì)照組人員均接受血液學(xué)檢查、胸片、腹部超聲、大小便常規(guī)等檢查，未發(fā)現(xiàn)任何異常。其中男性35名，女性15名，年齡(55.45±5.97)歲。所有受試者空腹靜脈采血5 mL，12 500 r/min離心15 min，分離血清于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有入選病例均詳細(xì)采集性別、年齡、腫瘤位置、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移情況、家族史、長(zhǎng)期煙酒史資料。本研究經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 主要儀器和試劑 AvantiTM30低溫高速離心機(jī)：美國(guó)Beckman公司；普通PCR儀：德國(guó)Eppendorf公司；Engine Opticon 2熒光定量?jī)x：加拿大MJ Research公司；miR-21引物：蘇州吉瑪基因有限公司；miRNAs提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；SYBR?Premix：天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 血清miRNAs提取 前期收集病例組與對(duì)照組血清樣本，血清總miRNAs提取具體步驟參照TIANGENmiRcute miRNA提取分離試劑盒說(shuō)明書(shū)，最后提取出血清總miRNAs溶解于30 μL RNase-FreeddH2O，-80 ℃冰箱保存待檢測(cè)。

1.4 血清miR-21檢測(cè) 使用TIANGEN逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在所提取的miRNA 3′末端加上多聚A尾，即Poly(A)，再使用Oligo(dT)-universal tag通用逆轉(zhuǎn)錄引物對(duì)miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，可生成對(duì)應(yīng)的cDNA，接下來(lái)利用合成miR-21特異性引物，miR-21引物上游：5-CT-CAACTGGTGTCGTGGAGTCG3′；下游:5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTT-3′;使用美國(guó)Applied Biosystems公司ABI 7500PCR儀進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，反應(yīng)體系為20 μL。模式：94 ℃ 2 min，94℃ 20 s，60 ℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)，最后一步做溶解曲線，設(shè)置為55～95 ℃，0.5 ℃/s，運(yùn)行儀器，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)完成后，記錄下各反應(yīng)管Ct值。若復(fù)孔間Ct值之差>1，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取2復(fù)孔Ct值平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR程序結(jié)束后，設(shè)定熒光閾值，設(shè)置的原則是要大于樣本的熒光背景值(前15個(gè)循環(huán)信號(hào))，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，使真正的信號(hào)是超過(guò)域值的熒光信號(hào)，從而得到各組PCR擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值。取各miRNA的平均Ct值，采用參照基因△Ct法分析，以內(nèi)在看家基因U6 snRNA表達(dá)Ct值作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平，計(jì)算公式為：2-(miRNAs-U6)。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌患者血清miR-21表達(dá)水平 食管癌患者血清中miR-21相對(duì)表達(dá)量為10.56±4.30，正常對(duì)照組血清中miR-21相對(duì)表達(dá)量為1.19±6.72，miR-21在食管鱗癌患者血清中表達(dá)水平明顯高于健康人群，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.2 食管鱗癌患者血清中miR-21表達(dá)水平與臨床病理特征之間的相關(guān)性 通過(guò)對(duì)不同性別、年齡、腫瘤位置、TNM分期、煙酒史、家族史的食管鱗癌患者外周血miR-21表達(dá)水平進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明在食管鱗癌患者中，miR-21表達(dá)水平與腫瘤位置、TNM分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移具有顯著的相關(guān)性。相對(duì)于胸上段的食管鱗癌患者，胸中、下段患者血清miR-21表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的食管鱗癌患者血清miR-21表達(dá)水平明顯高于其他患者(P<0.001)；臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期的患者血清miR-21表達(dá)水平較Ⅰ、Ⅱ期患者明顯上調(diào)(P<0.05)。而miR-21的表達(dá)水平與食管鱗癌患者的年齡、性別、腫瘤家族史、煙酒史等無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。表1。

表1 miR-21表達(dá)水平與臨床病理特征之間的相關(guān)性

注：*P<0.05，△P<0.001

3 討論

食管癌是我國(guó)的十大癌癥之一，其死亡率在我國(guó)癌癥總死亡率中占第四位[4]。據(jù)GLOBOCAN 2012數(shù)據(jù)顯示，2012年度全世界67億人口新發(fā)食管癌48.2萬(wàn)例，發(fā)病率為7.0/10萬(wàn)，居全部惡性腫瘤第9位；死亡40.7萬(wàn)例，死亡率5.8/10萬(wàn)，居第8位。中國(guó)大陸13.4億人口食管癌新發(fā)25.9萬(wàn)例，發(fā)病率為16.7/10萬(wàn)，居全國(guó)各類惡性腫瘤第5位；死亡21.1萬(wàn)例，死亡率為13.4/10萬(wàn)，居第4位[5]。目前臨床上大部分有臨床癥狀的食管癌患者，就診時(shí)病變已處于中晚期，失去早期治療的機(jī)會(huì)，一般中晚期患者術(shù)后五年生存率僅為10%～30%，而早期食管鱗癌術(shù)后5年生存率則可達(dá)80%～90%[6]，因此，如何提高食管癌的早期診斷，盡早治療對(duì)提高食管癌患者生存率具有重要意義。

MicroRNAs是一類高度保守的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，通過(guò)與靶基因3′端非編碼區(qū)發(fā)生不完全配對(duì)，從而調(diào)節(jié)靶基因mRNA翻譯、轉(zhuǎn)錄過(guò)程，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。miRNA在組織、細(xì)胞、外周血中的表達(dá)有顯著的腫瘤相關(guān)性、組織特異性和表達(dá)穩(wěn)定性[7]，作為致癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，有望成為新的生物標(biāo)志物。我們通過(guò)文獻(xiàn)的檢索和前期實(shí)驗(yàn)研究[8-9],發(fā)現(xiàn)miR-21在多種腫瘤中均表達(dá)升高，基于提高特異性的考慮，我們聯(lián)合選取miR-21作為候選檢測(cè)的miRNA，以前人的研究作為基礎(chǔ)，結(jié)合潮汕地區(qū)食管鱗癌高發(fā)的情況，通過(guò)檢測(cè)血清miR-21在食管鱗癌患者中的表達(dá)，探討miR-21表達(dá)在食管鱗癌中的臨床意義。結(jié)果表明，miR-21在食管鱗癌患者血清中的表達(dá)水平較健康對(duì)照者均顯著上調(diào)(P<0.001)，這一結(jié)果與上述基因在食管腫瘤組織與正常組織間表達(dá)失調(diào)的情況相符[10]，提示血清miR-21有作為食管鱗癌分子診斷標(biāo)志物的潛力。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-21的表達(dá)水平還與食管鱗癌患者遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況明顯相關(guān)：食管鱗癌伴遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的患者血清miR-21表達(dá)水平分別是不伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的2.0倍(P<0.05)，而伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者上述基因表達(dá)水平均為其他患者的1.6倍(P<0.05)。此外，不同臨床分期的食管鱗癌患者血清miR-21的表達(dá)水平也呈現(xiàn)出明顯的差異：臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期的患者血清miR-21表達(dá)水平分別為Ⅰ、Ⅱ期患者的1.5倍(P<0.05)。研究結(jié)果表明miR-21具有成為食管鱗癌預(yù)后生物標(biāo)志物的極大潛力。本研究還發(fā)現(xiàn)miR-21表達(dá)水平還與食管腫瘤的位置明顯相關(guān)(P<0.05)，而不同位置的食管腫瘤治療方法也不盡相同，解剖結(jié)構(gòu)的特殊性使得胸上段食管鱗癌的患者手術(shù)治療的可能性與胸中、下段腫瘤患者相比較小。因此，miR-21表達(dá)水平還可能對(duì)提示腫瘤位置、選擇治療方式具有參考意義。此外，本研究未發(fā)現(xiàn)miR-21的差異表達(dá)與年齡、性別、腫瘤家族史、長(zhǎng)期煙酒史等因素有明確關(guān)聯(lián)(P>0.05)。

本研究的樣本仍然較少，在今后的工作中將進(jìn)一步加大樣本量，取得更可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為食管癌的早期診斷找到有價(jià)值的血清指標(biāo)，并進(jìn)一步研究miR-21在食管鱗癌中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。