龍小平,戴仲秋,謝 軼

(四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，四川成都 610041)

長(zhǎng)奈瑟菌屬于奈瑟菌屬，從人體分離的大多數(shù)奈瑟菌被認(rèn)為是健康人群口咽部黏膜共生定居的細(xì)菌，長(zhǎng)奈瑟菌同樣也是口咽部的正常菌群,但在少數(shù)情況下可引起敗血癥、骨髓炎和感染性心內(nèi)膜炎。1969年有研究者首次對(duì)該菌進(jìn)行了描述，直到1983年研究者才報(bào)道了該菌的潛在致病性，主要見于牙科手術(shù)后及介入性心血管操作后，長(zhǎng)奈瑟菌所致感染的病例國(guó)內(nèi)報(bào)道甚少，目前國(guó)內(nèi)只有兩例引起感染性心內(nèi)膜炎的報(bào)道，未有該菌引起其他疾病的報(bào)道[1-2]。國(guó)外作為個(gè)案報(bào)告也較少，散在分布在多個(gè)多家，國(guó)外的報(bào)告中大多引起心內(nèi)膜炎[3-4]，還可以引起尿道炎、關(guān)節(jié)炎、腹膜炎等[5-6]。本案例是從1位感染性心內(nèi)膜炎患者血液中分離到該菌，從臨床病史資料、菌種鑒定等方面進(jìn)行如下報(bào)道，希望能引起臨床微生物工作者的注意。

1 臨床病史資料

患者，男，36歲，因“反復(fù)發(fā)熱50 d，咳嗽、咯痰1周”入住華西醫(yī)院感染科。患者于50 d前受涼后出現(xiàn)發(fā)熱，體溫未測(cè)，伴畏寒、寒戰(zhàn)，口服藥物后好轉(zhuǎn)(具體不祥)，但癥狀間斷反復(fù)，最高體溫39 ℃，曾使用“小柴胡、頭孢”等治療，癥狀好轉(zhuǎn)但仍反復(fù)發(fā)熱，1周前出現(xiàn)咳嗽、咯白色泡沫痰，入院當(dāng)天外院心臟彩超顯示二尖瓣前葉稍強(qiáng)回聲團(tuán)，考慮贅生物(請(qǐng)結(jié)合臨床，建議治療后復(fù)查)，左心房增大，左心室收縮功能測(cè)量值正常，舒張功能正常，心包積液(少量)?；颊邽檫M(jìn)一步診療就診于本院?；疾∫詠?lái)，體質(zhì)量下降約3 kg。既往一般情況良好，無(wú)心臟疾病史，近期無(wú)拔牙病史。入院查體：體溫36.4 ℃，脈搏102次/分，呼吸20次/分，血壓80/56 mm Hg，心臟二尖瓣區(qū)可聞及雜音，余無(wú)異常。初步診斷為發(fā)熱待查：感染性心內(nèi)膜炎可能性大。實(shí)驗(yàn)室檢查血常規(guī)白細(xì)胞15.33×109/L,參考范圍(3.5～9.5)×109/L，中性粒細(xì)胞百分比81.0%(參考范圍40%～75%)，C-反應(yīng)蛋白120 mg/L(參考范圍<5 mg/L)，PCT 100 ng/mL(參考范圍<0.046 ng/mL)，白細(xì)胞介素-6 35.76 pg/mL(參考范圍0～7 pg/mL)，乙型流感病毒陽(yáng)性，生化清蛋白21.5 g/L，心肌酶譜增高，其他生化免疫結(jié)果無(wú)明顯異常。入院3 d后復(fù)查心臟彩超顯示心瓣膜病，二尖瓣脫垂、穿孔繼發(fā)中度反流。入院后患者最高體溫40 ℃，先后給予左氧氟沙星，哌拉西林他唑巴坦，頭孢曲松聯(lián)合萬(wàn)古霉素聯(lián)合抗感染，奧司他韋抗病毒治療及其他對(duì)癥支持。經(jīng)治療后，患者發(fā)熱癥狀明顯好轉(zhuǎn)，患者炎性指標(biāo)明顯下降，轉(zhuǎn)入心臟外科行主動(dòng)脈瓣及二尖瓣機(jī)械置換術(shù)+心臟表面臨時(shí)起搏導(dǎo)線安置術(shù)，術(shù)后繼續(xù)抗感染治療。

2 細(xì)菌學(xué)檢查及結(jié)果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定 患者于入院即刻和入院5 h后分別各采集 2 套外周血送培養(yǎng)，共4套血培養(yǎng)送檢。4套血培養(yǎng)的需氧瓶分別于放入培養(yǎng)箱后22 h 32 min、33 h 25 min、19 h 38 min、20 h 8 min報(bào)陽(yáng)，厭氧瓶均陰性。涂片染色可見革蘭陰性球桿菌(見圖1)，轉(zhuǎn)種血平板和巧克力平板，35 ℃,5%CO2培養(yǎng)，24 h后血平板巧克力平板上可見1～2 mm、淡黃色、圓形、半透明、黏稠小菌落(見圖2)，麥康凱平板不生長(zhǎng)。取純培養(yǎng)革蘭染色為革蘭陰性球桿菌(見圖3)，氧化酶陽(yáng)性，觸酶陰性，補(bǔ)充微量生化管反應(yīng)硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性，不發(fā)酵葡萄糖，按一般陰性桿菌上VITEK2-Compact GN卡鑒定為殺蛙氣單胞菌，鑒定可信度95%。純培養(yǎng)經(jīng)Bruker MS質(zhì)譜儀鑒定后為長(zhǎng)奈瑟菌硝還亞種，分值為1.902分(見圖4)。該菌β-內(nèi)酰胺酶陰性，藥敏采用紙片擴(kuò)散法法，參照腦膜炎奈瑟球菌判斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)美羅培蘭、復(fù)方磺胺甲噁唑、頭孢曲松、氯霉素敏感。

圖1 血培養(yǎng)革蘭染色鏡下形態(tài)(×1 000)

圖2 血平板菌落形態(tài)(24 h)

圖3 純培養(yǎng)革蘭染色鏡下形態(tài)(×1 000)

圖4 長(zhǎng)奈瑟菌質(zhì)譜圖譜

2.2 分子生物學(xué)方法鑒定 采用16S rRNA 序列分析法，將細(xì)菌送成都擎科梓熙生物科技有限公司測(cè)序，正向游引物名稱27F，5′-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3′反向游引物名稱1492R，P2 5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG AC-3′，目的片段約為 1 500 bp 。PCR反應(yīng)體系 50 μL： PCR Mix 25 μL，正反向游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，dH2O 22 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR產(chǎn)物的特異性，用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將PCR產(chǎn)物電泳條帶切割所需 DNA 目的條帶，純化PCR產(chǎn)物用引物直接測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)網(wǎng)站中用 BLAST進(jìn)行序列比較，選取比較長(zhǎng)度1 137 bp，分析結(jié)果為長(zhǎng)奈瑟菌硝酸鹽還原亞種(Neisseria elongate subsp.nitroreducens strain，NR104944.1)，鑒定相似度為99.83%。

3 討 論

感染性心內(nèi)膜炎是由病原菌感染心臟內(nèi)膜表面引起的心瓣膜或心室壁內(nèi)膜的炎癥，血培養(yǎng)陽(yáng)性是確診感染性心內(nèi)膜炎的重要依據(jù)，能為臨床用藥提供依據(jù)。文獻(xiàn)表明細(xì)菌性心內(nèi)膜炎主要致病菌是草綠色鏈球菌，其次是金黃色葡萄球菌，同時(shí)有少量的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，較多的感染性心內(nèi)膜炎有先天性心臟病、風(fēng)濕性心臟病等心臟基礎(chǔ)疾病或心臟介入等病史[7-8]。本病例中，患者無(wú)心臟疾病病史和有創(chuàng)操作病史，病程長(zhǎng)，心臟超聲提示心臟贅生物，考慮感染性心內(nèi)膜炎，經(jīng)血培養(yǎng)后確定病原菌為長(zhǎng)奈瑟菌，因該菌為口咽部的正常菌群，但四瓶血培養(yǎng)均為此菌，可除外污染。該病的治療抗感染的時(shí)間較長(zhǎng)，往往需要手術(shù)治療[9]，該患者經(jīng)抗感染治療癥狀好轉(zhuǎn)后行心臟手術(shù)治療。

長(zhǎng)奈瑟菌屬于奈瑟菌屬，有3種亞型，分別為硝酸鹽還原亞種，長(zhǎng)亞種、解糖亞種，硝酸鹽還原亞種為主要的致病亞種，這與大多數(shù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]。該菌為專性需氧，革蘭陰性球桿菌，氧化酶陽(yáng)性,觸酶弱陽(yáng)性或陰性。因該菌鏡下形態(tài)和生化反應(yīng)與屬內(nèi)其他奈瑟菌有較大差異，常規(guī)鑒定易導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果，本院及我國(guó)之前報(bào)告的2例分離菌株按一般的革蘭陰性桿菌用VITEK-2 Compact GN鑒定卡，結(jié)果均鑒定錯(cuò)誤，1株為解脲寡源桿菌(鑒定可信度 97%)和2株為殺蛙氣單胞菌(鑒定可信度 98%和95%)；其中1株用苛養(yǎng)菌鑒定卡鑒定為長(zhǎng)奈瑟菌(鑒定可信度 97%)，3株用Bruker MS或VITEK MS質(zhì)譜鑒定均為長(zhǎng)奈瑟菌，并且本院Bruker MS準(zhǔn)確的鑒定到了亞型；最終3例用16 SrRNA分子生物學(xué)方法測(cè)序結(jié)果為長(zhǎng)奈瑟菌[1-2]。

在本案例中，長(zhǎng)奈瑟菌雖然為人體口咽部的正常菌群，但是在口咽部以外的地方尤其是血液中分離到此菌，應(yīng)該引起檢驗(yàn)人員的重視，感染性心內(nèi)膜患者血培養(yǎng)規(guī)范的送檢至關(guān)重要，對(duì)于懷疑感染性心內(nèi)膜炎的患者，應(yīng)在發(fā)病12～24 h內(nèi)從不同的靜脈抽取3套血培養(yǎng)，每套至少間隔1 h，24 h內(nèi)仍報(bào)告陰性者，或者治療期間患者發(fā)熱或沒有好轉(zhuǎn)還應(yīng)再采集2套血培養(yǎng)，全部培養(yǎng)一共5套[10]，目前較多的醫(yī)院仍然是單套送檢，有可能會(huì)被當(dāng)做污染菌處理，嚴(yán)重影響患者的診療。此外，應(yīng)嚴(yán)格把握血培養(yǎng)的送檢指征，對(duì)反復(fù)發(fā)熱的患者應(yīng)及時(shí)規(guī)范送檢血培養(yǎng)[11]。再次，該菌的鑒定比較困難，較多的醫(yī)院沒有時(shí)間飛行質(zhì)譜儀，如果采用梅里埃的GN卡，可能會(huì)出錯(cuò)，對(duì)于儀器鑒定度不高時(shí)，不應(yīng)完全相信儀器的結(jié)果，醫(yī)院可以備用苛養(yǎng)菌鑒定卡。最后，檢驗(yàn)科微生物室與臨床的溝通也很重要，當(dāng)一些特殊的感染培養(yǎng)出少見的該部位致病菌時(shí)或者血培養(yǎng)中出現(xiàn)某些部位的正常菌群時(shí)，更應(yīng)加與強(qiáng)臨床的溝通。