吳 曼，龔 云，彭 穎，張文玉，鄒 添，陳 亮

(1.湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002; 2.湖北大別山國家級自然保護區(qū)英山管理局，湖北 黃岡 438700)

0 前言

銅是植物生長發(fā)育必需的微量營養(yǎng)元素, 在細胞中，銅元素的存在形式為Cu+和 Cu2+，在植物的生長發(fā)育過程中行使重要功能，以含銅蛋白的形式參與各種新陳代謝過程，如光合作用、呼吸作用電子傳遞鏈、活性氧代謝、對乙烯的感受、氮代謝、細胞壁的木質(zhì)化及花粉的形成等[1]。植物在根毛部位協(xié)同水分代謝活動，能夠通過單向運輸載體蛋白順著濃度梯度單向運輸或主動運輸把銅運至細胞內(nèi)。通過共質(zhì)體、質(zhì)外體途徑運輸?shù)礁膬?nèi)部，再由蒸騰拉力和根壓運輸?shù)街参锏母鱾€部位，以酶的方式參與植物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，并影響植物的呼吸作用。但是當環(huán)境條件中銅的含量超過其最大承受時，植物就會受到脅迫，進而對植物造成影響。

黃石大冶銅錄山銅礦遺址土壤中累積大量的重金屬銅礦廢棄物，造成嚴重的土壤重金屬污染[2～3]，但杠板歸的生長卻十分繁茂。杠板歸(PolygonumperfoliatumL)，是一種一年生攀援草本植物，蔓生在野路旁。由于其中藥功效，又名河白草、蛇倒退、梨頭刺、蛇不過等。束文圣等人對該礦區(qū)杠板歸等5種優(yōu)勢物種對重金屬的吸收積累和遷移特性進行測定和比較，發(fā)現(xiàn)它們對Cu表現(xiàn)出了很高耐性[2]。且許多研究表明，杠板歸對錳等重金屬具有較強的富集作用，可以用于錳等重金屬污染的治理修復(fù)[4]。但劉小紅等人發(fā)現(xiàn)雖然杠板歸以及鴨趾草對長江沿線銅礦區(qū)Cu有較多的吸收[5]，卻不足以達到富集量與生物量比值大于1000 mg·kg-1的超富集水平[6]。盡管目前有關(guān)杠板歸的研究工作已經(jīng)取得一定進展，但是大部分研究主要集中在將杠板歸作為中藥材論述其應(yīng)用以及栽培技術(shù)等方面，在對銅的抗脅迫作用的研究卻鮮見報道。我們在銅錄山銅礦區(qū)和生活區(qū)(湖北師范大學(xué)區(qū)劃范圍內(nèi))都發(fā)現(xiàn)杠板歸的分布，但在礦區(qū)的耐受型和生活區(qū)的敏感型杠板歸植株顏色和葉子形狀都有明顯差異。由此我們實驗室采集礦區(qū)耐受型杠板歸和對照組敏感型杠板歸，通過對比銅離子對兩種生態(tài)型杠板歸形態(tài)和光合作用兩方面生理特征的影響，希望可以初步探究杠板歸抗銅離子脅迫的生理機理，并為礦區(qū)對銅等重金屬的生物治理提供理論支撐和指導(dǎo)。

1 實驗方法

1.1 杠板歸樣本采集與培養(yǎng)

采集來自大冶市銅錄山和湖北師范大學(xué)校園內(nèi)的杠板歸，采樣時盡量選取生長良好的幼嫩枝條，從頂端往下剪取10～15cm枝條。將采集到的杠板歸進行水培，用CuSO4·5H2O以1/2Hoagland營養(yǎng)液作為基礎(chǔ)液配成不同濃度梯度的含銅離子的培養(yǎng)液，分別為0 μg/mL,100 μg/mL,200 μg/mL,300 μg/mL,400 μg/mL 5個濃度梯度，每個梯度每種類型2個重復(fù)，置于正常光照下培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每隔3天換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)約7天。

1.2 形態(tài)特征的測定

每組選取3～5株材料長勢一致、生長狀態(tài)良好的杠板歸進行根長、株高等形態(tài)指標測定。測量根長(即第一個根毛基處至最末端的根尖之間的長度)和莖長(即由第一個根毛基處至莖頂端的長度)。

1.3 葉綠素含量的測定

從每個濃度銅離子處理的杠板歸中選取葉片0.5 g，剪成碎塊，每組設(shè)置3個重復(fù)，利用丙酮提取法浸提，以80%丙酮為對照，分別測定663 nm、645 nm處的吸光值[7]。根據(jù)Lamber-beer定律，利用公式：

Ca=12.7OD663-2.69OD645Cb=22.9OD645-4.68OD663

CT=Ca+Cb

求出紅、綠桿馬齒莧中葉綠素a、b的含量。

1.4 光合指標的測定

從每個濃度銅處理的杠板歸選取6片大且無損傷的葉片利用 TPS-2光合儀進行葉片蒸騰速率(E)，氣孔導(dǎo)度(G)，凈光合速率(A)，細胞間CO2的濃度(CI)的測量。

2 實驗結(jié)果

2.1 形態(tài)特征比較

2.1.1 兩種杠板歸根莖葉形態(tài)差異

通過形態(tài)上觀察，我們發(fā)現(xiàn)耐受型(銅錄山組)根系較為發(fā)達，基部粗壯，莖干直徑較大；敏感型(校園本地)根部較弱，且莖干直徑較小植株多呈現(xiàn)倒伏狀。如圖1所示。

A B

2.1.2 莖長和根長的增長情況

由圖2分析得，兩種生態(tài)型的杠板歸的根與莖的增長率分別呈先上升后下降的趨勢，且耐受型的根和莖的增長率一直高于敏感型的杠板歸。同時，敏感型的根與莖在100 mg/L銅離子濃度時有最大增長率，耐受型的根與莖在150 mg/L的銅離子濃度時有最大增長率，且耐受型杠板歸植株的莖稈和根系增長率呈現(xiàn)較大的區(qū)別。

圖2 不同Cu2+濃度下兩種生態(tài)型杠板歸的根和莖的增長率，不同字母表示在0.05水平的顯著差異

2.2 光合指標比較

由圖3可知，在經(jīng)過不同銅濃度處理兩周后，敏感型杠板歸的氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率均隨著銅離子的濃度增高呈減小的趨勢，且銅離子濃度為200 mg/L時，其數(shù)值最?。欢褪苄透馨鍤w的氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率均隨著銅離子濃度的增高呈增大的趨勢，且銅濃度為150 mg/L時，其數(shù)值最大(A、C圖)。

Cu2+Concentration(mg/L)

圖3 不同銅離子濃度處理下兩種生態(tài)型杠板歸氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳濃度、蒸騰速率、光合速率指標

Cu2+Concentration(mg/L)

圖4 不同銅離子濃度下杠板歸葉綠素總含量

耐受型和敏感型杠板歸的細胞間二氧化碳濃度、光合速率均隨著銅濃度的增加而降低，且耐受型杠板歸在銅離子濃度為200mg/L時，光合速率最低為1.88；在銅離子濃度為100 mg/L時最高達到4.00；敏感型杠板歸在銅離子濃度為200 mg/L時，光合速率最低為0.90；在銅離子濃度為150 mg/L時最高達到2.10 .但耐受型杠板歸胞間二氧化碳濃度、光合速率始終在敏感型杠板歸之上(B、D圖)。

2.3 葉綠素含量比較

由圖4 A可知，耐受型杠板歸的葉綠素b的含量要高于葉綠素a的含量，葉綠素b的含量在銅離子濃度為200 mg/L時達到最大，葉綠素a的含量在銅離子濃度為150 mg/L時達到最大；由圖4 B可知，敏感型杠板歸的葉綠素a的含量首先高于葉綠素b的含量，在銅離子濃度為150 mg/L后，葉綠素b的含量要高于葉綠素a的含量，葉綠素b的含量在銅離子濃度為150 mg/L時達到最大，葉綠素a銅離子濃度為150 mg/L時達到最大。

3 討論分析

植物常常通過在形態(tài)和生理等方面采取不同的響應(yīng)機制來應(yīng)對不良環(huán)境。目前，國內(nèi)外學(xué)者研究了多種植物在銅污染條件下的生長，結(jié)果表明，低濃度的銅離子能夠促進植物種子萌發(fā)和生長，但當銅離子濃度繼續(xù)增加后，對植物生長產(chǎn)生不同程度的抑制作用[8～9]，甚至死亡[10]。如張剛等人[11]研究發(fā)現(xiàn)適量的銅對黑麥草生長起到促進作用，但是超出了閾值的銅對生長有抑制，會使其生長緩慢，根停止生長，最終枯死；植株矮化，葉黃化，這與我們的實驗結(jié)果一致(圖1)，驗證了我們的結(jié)論。另外，由根和莖的增長率可以看出(圖2)，杠板歸在適應(yīng)不同的環(huán)境時，會產(chǎn)生不同的響應(yīng)機制，在營養(yǎng)分配上的表現(xiàn)較為突出。在離子脅迫下，刺激根系生長，改變生長中心，調(diào)控生長優(yōu)勢部位，減低地上蒸騰部位比例，以適應(yīng)環(huán)境變化。而在我們實驗中耐受型較之于敏感型發(fā)達的根系以及更強的根莖增長率也進一步驗證了這個論斷。

光合作用是植物生命活動的基礎(chǔ)，是產(chǎn)生能量的重要來源，因此環(huán)境脅迫下植物光合作用的強弱也是反映植物生長狀況重要生理指標。王鈞[12]等人研究表明與對照組相比，在低濃度處理時耐受型杠板歸的氣孔導(dǎo)度、光合速率均上升，胞間二氧化碳濃度下降，高濃度處理后兩種杠板歸的氣孔導(dǎo)度、光合速率均下降，胞間二氧化碳濃度上升。本實驗中，隨著銅離子濃度的升高，耐受型杠板歸的各項指標始終位于敏感型之上，通過文獻調(diào)研我們知道高等植物進行光合作用第一重要生產(chǎn)的物質(zhì)是葉綠素，它含量的高低是影響光合作用強弱的重要因素，因此葉綠素動態(tài)變化可以反映植物受環(huán)境脅迫后的生理狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，在Cu2+脅迫處理下，活性氧在細胞中增加，其更多地擴散到葉綠體內(nèi)，從而加速了葉綠素的降解[13]；同時，由于Cu2+局部積累過多，與葉綠體中蛋白質(zhì)-SH 結(jié)合或取代其中的Fe2+、Zn2+、Mg2+，致使葉綠素蛋白中心離子組成發(fā)生變化而失活[14],且葉綠素a不及葉綠素b穩(wěn)定，所以葉綠素a的降幅大于葉綠素b 。本試驗結(jié)果表明，不同濃度Cu2+處理下，敏感型杠板歸葉片葉綠素總量、葉綠素a、b含量明顯變化，且葉綠素a / b下降；耐受型杠板歸葉片葉綠素總量、葉綠素a、b含量變化較為平緩，且葉綠素a / b比值增大，由此說明在同等脅迫條件下銅錄山(耐受型)杠板歸光合作用相對于敏感型更強，因而植株更為健壯從而增強對脅迫的耐受型。

當然除開外觀形態(tài)、光合生理指標方面，耐受型和敏感型植株都表現(xiàn)出明顯差異，且通過我們實驗也證實在較高濃度銅脅迫條件下植株生長更為良好，但是這兩種不同生態(tài)型杠板歸在銅脅迫下，其他生理指標中存在哪些差異仍需進一步探究。