羅建 范新榮 葉強 魏燕 李新 劉應才

心房顫動(簡稱房顫)是臨床上最常見的一種心律失常.既往已有部分實驗研究證實房顫發(fā)病機制與心房肌基因及蛋白表達異常相關.大力水手結構域(Popdc)是新發(fā)現(xiàn)的蛋白家族(Popdc1、2、3),由包含三個跨膜域膜蛋白的基因編碼,蛋白質(zhì)的羧基末端部分定位于細胞質(zhì),包含一個高度保守序列的蛋白質(zhì)域.Popdc內(nèi)包含環(huán)磷酸腺苷(c AMP)高親和力的結合位點,在c AMP的介導下,Popdc蛋白與鉀通道TREKG1相互作用,增加細胞表面的鉀通道的通透性,增加外向電流強度,從而引發(fā)快速型心律失常[1].Popdc1、2、3在心臟和骨骼肌都有豐富表達[2],其中Popdc1和Popdc2在心臟傳導系統(tǒng)中包括竇房結和房室結有高水平的表達[3].既往GWAS研究發(fā)現(xiàn)Popdc1基因與房顫的發(fā)病相關[4],并認為Popdc在小鼠骨骼和心肌受應激或壓力時發(fā)揮重要作用.Popdc1或Popdc2敲除小鼠動物受到應激時,會出現(xiàn)嚴重的竇房結功能紊亂及房性心律失常,并且心律失常發(fā)生與年齡增長呈正相關[5].Popdc1還在終末期心力衰竭患者的心臟中表達量下降[6],且對小鼠心肌缺血再灌注損傷有保護作用[7].但Popdc亞型的表達是否與房顫的發(fā)生及維持相關,且與房顫患者的相關因素的相關關系仍未研究清楚,本實驗采用外科心臟手術病人的右心耳為研究對象,驗證Popdc亞型在人心耳中的表達,同時結合病人的年齡、性別、紐約心功能分級、基礎疾病等臨床數(shù)據(jù),分析Popdc表達變化與房顫的相關性.

1 資料與方法

1．1 資料來源 選取2018年6月至2018年12月在本院行心臟外科手術患者34例(瓣膜置換術32例、心房粘液瘤切除術1例、房間隔修補術1例),分為竇律組14例和房顫組20例.根據(jù)心電圖記錄,房顫定義為P波消失,代之f波,心房率350~600次/分,QRS波節(jié)律絕對不規(guī)則,表現(xiàn)為RR間期不勻齊,QRS波形態(tài)多正常.診斷標準依據(jù)?心房顫動:目前的認識和治療的建議G 2018?[8].排除標準:①有感染性心內(nèi)膜炎;②臨床上有風濕性活動征象;③患者及家屬不同意者.用無菌、無RNA酶的1．5 ml Eppendorf管快速收集進行開胸心臟手術患者的右心耳組織50~100 mg,用于IHC染色和Massom染色的標本用4%多聚甲醛固定液固定;用于 Western blot和qPCR的組織標本立即在液態(tài)氮冷凍和儲存在－80℃.人體組織采集方案經(jīng)本院倫理委員會批準并獲得患者家屬的書面知情同意.在實驗分析結束以前,所有標本的病人的信息是匿名編碼的,實驗結束之后公開,病人的特征見表1.

表1 兩組間臨床資料的比較

1．2 超聲心動圖 所有患者術前常規(guī)行超聲心動圖檢查,采用Philips iE33超聲系統(tǒng)(Andover,Md．,USA),1~5 MHz換能器,根據(jù)中國成年人超聲心動圖檢查測量指南[9],患者行左側位檢查.采集指標:LAD、RVD、LVESD、LVEDD、RAD、LVEF,LVEF＝(LVEDDGLVESD)/LVEDD×100%.

1．3 IHC染色和Masson染色 將心耳組織從4%多聚甲醛固定液中取出,用組織脫水機(Leica,德國)、組織包埋機(Leica,德國)和組織切片機(Leica,德國)完成不同濃度的酒精脫水和石蠟包埋、切片.然后行Masson染色和IHC染色,免疫組化的抗體分別為兔多克隆抗體識別的Popdc1(1/500稀釋,Affinity,中國,常州)、小鼠多克隆抗體識別的PopG dc2(1/1 000稀釋,Abcam,中國,上海)、兔多克隆抗體識別的Popdc3(1/1 000稀釋,Abcam,中國,上海).通過Case Viewer平臺觀察結果.用IPP6．0分析免疫組化和Masson染色結果.

1．4 免疫印跡試驗 將存儲在－80℃冰箱的心耳樣本用液氮研磨成粉末狀,然后提取到高強度的RIPA蛋白裂解液(含1%蛋白酶抑制劑)中,14 000 g離心15 min,取上清液,用BCA法測定蛋白濃度.將提取的樣本蛋白在99°C變性7 min.變性的蛋白用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS/PAGE)分離,然后轉移到聚偏二氟乙烯上(ImmunGBlotPVDF膜;BioGRad,Hercules,CA,USA).在室溫下,用含有5%脫脂牛奶的吐溫G20(TBST)緩沖鹽水封閉膜1 h.膜分別用兔多克隆抗體識別的Popdc1(1/500稀釋,Affinity,中國,常州)、小鼠多克隆抗體識別的Popdc2(1/1 000稀釋,Abcam,中國,上海)、兔多克隆抗體識別的Popdc3(1/1 000稀釋,Abcam,中國,上海)和GAPDH(1/4000稀釋,Beyotime,中國,上海)在4°C孵育過夜(大約14 h).在TBST洗滌后,膜放在相應的二抗中室溫下結合1 h.在TBST中再次洗滌印跡,使用化學發(fā)光液(advansta,美國,門洛帕克市)檢測條帶,使用 Quantity One software version 4．2．6(BioG Rad)進行定量.免疫印跡實驗至少重復3次.GAPDH蛋白作為內(nèi)參蛋白.計算檢測到的PopG dc1蛋白條帶相對于同一個體GAPDH條帶的平均歸一化光密度(OD),并進行統(tǒng)計分析.

1．5 定量聚合酶鏈反應 基因表達用TB Green realGtime qGPCR(CFXGconnect RealGTime PCR DeG tection System,BioGRad)進行實時PCR驗證.用液氮將冷凍組織樣本研磨成粉末狀,用Trizol試劑(15596018,Invitrogen)從粉末中提取組織總RNA,經(jīng)氯仿提取、異丙醇沉淀、去DNA雜質(zhì)處理、聚丙烯酰胺凝膠電泳質(zhì)控.用分光光度計測定RNA濃度和純度.RNA溶液被儲存在－80℃直至使用時.抽取2μg的總RNA,然后用(RR047B,Takara)逆轉錄.Popdc1、Popdc2、Popdc3和GAPDH序列由擎科生物(中國,成都)提供.Popdc1(F:5′“G TCTCCCTTCCCTCTTTCCG3′;R:5′GCACAGG CATCCTACCATTCCG3′)Popdc2(F:5′“GAGGAGG CAGGCATTGGTAGG3′;R:5′GCCCTGTGGTG GGGTTTG3′)和 Popdc3(F:5′“GTGCCTTGAATG GACAGGGTG3′;R:5′GAGGGGTGATCTGCGG TATTTG3′),GAPDH(F:5′GGGGGCTCTCG CAGAACATCG3′);R:5′GTGACACGTTGG GCAGTGGG3”).qPCR反應混合物包含包含10μl TB Green Premix Ex TaqⅡ2×(Tli RNase H Plus,Takara,Japan),2μl cDNA,0．4μl ROX Reference Dye II(50×),0．8μl 10 umol/L上游引物和0．8μl 10 umol/L下游引物,6μl無RNA酶的滅菌用水,最后混合成一個20μl的體系.qPCR循環(huán)程序分為兩步.第一步為95℃,持續(xù)30 s,第二步為95℃反復循環(huán)45次,變性時間為5 s,退火溫度為60℃,持續(xù)30 s.通過監(jiān)測熔融溫度曲線和瓊脂糖凝膠電泳試驗,優(yōu)化了qPCR反應條件.使用Mastercycler Ep Realplex軟件2．0版(Eppendorf,Hamburg,Germany),將每個樣本的閾值循環(huán)(CT)值與各自標準曲線的CT值進行比較,計算出目標cDNA的起始量.靶基因表達水平歸一化為GAPDH轉錄水平.

1．6 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示.n代表樣本例數(shù).采用配對和/或非配對的T檢驗來評估兩組均值差異的統(tǒng)計學意義.采用線性回歸的方法對蛋白或m RNA的含量與年齡、性別、RHD的相關性進行分析.P＜0．05為有統(tǒng)計學意義.數(shù)據(jù)分析采用SigmaPlot12．5,USA分析.作圖采用GraphPad Prism 8,USA.

2 結果

2．1 兩組病例資料的比較 與竇律組比較,房顫組女性多、風心病多、LA增大、LVEF下降,差異有顯著性(P均＜0．05或0．01),見表1.

2．2 兩組右心耳組織纖維化程度(Masson染色)的比段 藍染的膠原纖維在兩組患者的右心耳肌束間均可看到,見圖1.包裹著心肌組織的膠原纖維在房顫組比竇律組增生顯著(0．66±0．09 vs 0．40±0．05,P＝0．0002).

圖1 兩組Masson染色切片的對比

2．3 兩組免疫組化(IHC)染色的比較 Popdc1、Popdc2、Popdc3均表達于心肌細胞之間的連接中,包括橫管、縱管和閏盤.房顫組Popdc1、Popdc3在右心耳中的表達都明顯強于竇律組,分別為0．06±0．01 vs 0．04±0．01,0．06±0．01vs0．05±0．01,P均＜0．05;而Popdc2在兩組間的表達無明顯差異,0．06±0．002 vs 0．07±0．02,P＞0．05.見圖2.

2．4 兩組Popdc蛋白的比較 房顫組Popdc1、Popdc3在右心耳中的表達亦都明顯強于竇律組,分別為1．44±0．51 vs 1．08±0．33、1．75±0．70 vs 1．06±0．11,P均 ＜0．05;而Popdc2在兩組間的表達無明顯差異,1．49±0．55 vs 1．21±0．53,P＞0．05.見圖3.

圖2 兩組Popdc1－3免疫組化染色切片比較

圖3 兩組Popdc1－3蛋白表達量的電泳比較

2．5 兩組Popdc mRNA的表達 房顫組Popdc1、Popdc3在右心耳中的表達也都明顯強于竇律組,分別 為1．34±0．65 vs 1．07±0．42、1．23±0．40 vs 1．03±0．26,P＜0．05;而Popdc2的房顫組與竇性組之間表達無明顯差異,1．05±0．49 vs 1．08±0．37,P＞0．05.

2．6 Popdc與房顫等其他因素的相關性 房顫與Popdc1和Popdc3的蛋白和m RNA表達均成正相關,但與Popdc2的表達無相關性,見表2.除房顫組Popdc2 m RNA的表達與性別相關以外,其余Popdc的表達與年齡、性別或NYHA無相關性,見表3.

表2 Popdc與房顫的相關性

3 討論

3．1 本研究發(fā)現(xiàn) 本研究發(fā)現(xiàn)風心病增加了房顫的發(fā)病風險,女性可能比男性更容易患風濕病,從而更多發(fā)生房顫.房顫可導致房室肥厚,左房增大,LVEDD、LVEF降低,這也符合房顫的病理生理變化[10].同時,房顫患者的心肌纖維化較竇性患者明顯增加,提示心肌結構重構可能會影響Popdc表達水平.慢性房顫患者Popdc1和Popdc3免疫組化染色增加,Popdc2的表達無明顯異常.且蛋白表達水平、m RNA水平提示相同的變化趨勢.

3．2 與既往結果比較 在免疫熒光染色下,發(fā)現(xiàn)Popdc1和Popdc2存在于小鼠心肌細胞之間的連接中[3],這與本研究觀察到的結果相同.Tan等[4]報道Popdc1與心律失常相關,并且與房顫相關,但具體關系未闡明,本研究發(fā)現(xiàn)房顫患者的Popdc1和Popdc3表達增強.然而,本研究沒有發(fā)現(xiàn)房顫組和竇律組患者在Popdc2水平上的差異.可能的解釋為人類基因組中,Popdc1和Popdc3在人類染色體6q21上呈串聯(lián)排列基因,而Popdc2定位于人類染色體3q13．33[1],亞基1、3與亞基2在不同的染色體上.從而調(diào)控Popdc1、3亞基的表達與Popdc2亞基表達出現(xiàn)分離的現(xiàn)象.另外有研究證實,斑馬魚中Popdc2的缺失會導致心律失常,包括竇性心動過緩,房室傳導阻滯,竇房阻滯[5].當Popdc1或Popdc2缺陷小鼠動物受到物理或者精神應激時,會出現(xiàn)嚴重的竇房結功能紊亂及心房心律失常發(fā)生,并且與年齡有關[3].所以筆者推測Popdc1與PopG dc3與房顫等房性心律失常明顯相關,而Popdc1與Popdc2與緩慢性心律失常發(fā)生機制相關.有研究表明在慢性終末期心力衰竭病人的心肌組織中,Popdc1的表達下調(diào)[6].考慮心衰患者多合并有房顫,房顫患者晚期多進展為心力衰竭,房顫和心力衰竭有許多共同的發(fā)病機制,這與本研究的結果改變不一致.筆者認為可能是早期代償效應,且本研究選取的患者均不是終末期心衰患者,且心房與心室肌細胞表達存在差異,但具體的機制需進一步的基礎實驗驗證.

表3 Popdc與其他因素的相關性

3．3 心臟不同部位Popdc表達的差異 在本研究中,我們收集了右心耳作為代表.房顫的觸發(fā)和維持主要發(fā)生在左心房,但右心耳比左心耳更易取樣,且左右心耳基因表達具有一致性[11－13].由于大多數(shù)關于人體組織的研究僅限于右房的[14],因此在臨床上收集左右心耳是很困難的.因此認為右心耳組織可代表整個心房的病理變化,可作為研究材料闡明房顫的發(fā)病機制.

3．4 Popdc的重塑與疾病等因素的關系 本研究發(fā)現(xiàn)房顫與性別、風心病、LAD、LVEDD等臨床參數(shù)存在明顯的正相關關系.值得注意的是,越來越多的女性罹患房顫[15].進一步研究表明年齡、性別和風心病、心功能分級對Popdc蛋白和基因的表達無顯著影響.房顫的發(fā)病率和患病率隨著年齡的增長而增加.隨著年齡的增長,心房離子通道的結構和功能的改變?yōu)榉款澃l(fā)生及維持提供了結構基質(zhì)[16].但本研究沒有發(fā)現(xiàn)年齡變化對Popdc的表達有顯著影響,可能是樣本例數(shù)較少的限制.

3．5 研究的局限性 由于取材的限制,本研究的樣本量較小,目前的研究數(shù)據(jù)不能推廣及所有房顫患者.此外,藥物可能會影響離子通道蛋白和基因的表達.我們的結論發(fā)現(xiàn)房顫與Popdc蛋白的上調(diào)有關.然而,啟動Popdc通道重構的具體因素尚不清楚.可能與房顫中能量代謝異常、離子通道重構及Popdc與鉀離子通道脫偶聯(lián)等機制相關,尚需進一步基礎研究驗證其致病機制.