陳躍，馮亞東，趙向陽

（1.南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院/東南大學附屬中大醫(yī)院溧水分院 消化科，江蘇 南京 211200；2.東南大學附屬中大醫(yī)院 消化科，江蘇 南京 210009）

肝膽系統(tǒng)的重要功能之一是膽汁的形成與分泌，該系統(tǒng)的功能失調(diào)可導致多種膽囊和膽道疾病，例如膽汁組成成分的不平衡會導致膽結(jié)石的形成，膽汁分泌過程的受阻會出現(xiàn)膽汁瘀滯[1-2]。膽汁的主要成分包括膽固醇、磷脂、膽汁酸等，其中水、離子或非離子溶質(zhì)成分通過跨細胞與細胞旁途徑的運動主要受滲透壓驅(qū)動，上皮細胞間通過緊密連接的形式形成細胞旁屏障，緊密連接蛋白（claudin，簡稱Cldn）是細胞-細胞黏附分子在緊密交界處形成的細胞旁屏障，其中Cldn2在肝細胞與膽管細胞中高度表達[3]。有研究顯示在Cldn2基因敲除的小鼠中細胞旁通透性和陽離子選擇性缺陷可損害腎臟近端小管對Na+、Cl-和水的重吸收，顯示出Cldn2在細胞旁屏障的形成及調(diào)節(jié)生物功能等方面具有重要作用[4-5]。本實驗旨在探究小鼠Cldn2基因敲除后對膽汁流動及膽固醇結(jié)石形成的影響。

1 資料和方法

1.1 實驗動物

自上海南方模式生物科技股份有限公司購買Cldn2-/-基因敲除小鼠（Cldn2-/-組）與Cldn2+/+野生型小鼠（Cldn2+/+組） （每組20只），周齡8～12周，給予致石飲食，致石飼料成分包括83.5%全價飼料、1.0%膽固醇、15.0%脂肪、0.5%膽酸，飼養(yǎng)時間為4周；小鼠禁食4 h但自由飲水后進行相關的實驗研究。本研究所有操作和相關內(nèi)容均經(jīng)動物倫理委員會知情同意。

1.2 膽汁流速及成分檢測

小鼠麻醉后固定于保溫板上，并恒溫于37.0 ℃。結(jié)扎膽囊管后，使用30號針頭插入膽總管內(nèi)，采集膽汁1 h確定流速及膽汁成分。膽汁的生化分析中首先收集肝臟和膽囊膽汁樣本，通過便攜式離子計（Horiba，Kyoto）測量鈉離子和鉀離子含量，除此以外檢測的成分還包括總膽固醇、磷脂、非酯化脂肪酸、總膽汁酸和總膽紅素水平。

1.3 跨上皮水滲透檢測

將封閉的肝內(nèi)膽管單位（IBDU）在室溫下置于HEPES的緩沖液（120 mmol/L NaCl，滲透壓300 mOsm）中預孵育15 min，然后置于低滲HEPES緩沖液（35 mmol/L NaCl，滲透壓100 mOsm）或高滲HEPES緩沖液中（120 mmol/L NaCl，滲透壓500 mOsm），通過測量管腔面積的變化間接反映封閉IBDU中水的進出，通過對小鼠膽管單元描述的方法由Image-J軟件進行分析。按照同樣的方法預孵育具有膽小管樣結(jié)構(gòu)的肝細胞，15 min后將肝細胞置于高滲HEPES緩沖液（120 mmol/L NaCl，滲透壓500 mOsm）中評估小管腔內(nèi)的水運動。

1.4 膽管電生理分析

按照既往文獻報道的方式測量膽總管的電生理學參數(shù)[6]。簡而言之，仔細分離膽總管后，將近端膽管套扎固定于雙腔灌注導管中，導管遠端置于涂有Sylgard的移液管中，通過移液管向膽囊腔內(nèi)施加500 nA的電流，通過電極測量跨上皮電壓，進一步分析跨膜電壓和離子通透性。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析，計量資料采用（±s），組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Cldn2基因敲除后降低膽汁流速，提高膽汁脂質(zhì)濃縮比

通過采集的膽囊膽汁宏觀比較顯示Cldn2-/-組與Cldn2+/+組相比膽汁的顏色更深更加濃縮（見圖1），但兩組小鼠的膽囊容量比較無統(tǒng)計學差異[（22.3±4.1）μLvs（23.5±2.2）μL，P=11.8]；Cldn2+/+組的膽汁流速為（58.0±4.4）μL/（min·kg），約為Cldn2-/-組（29.0±3.3）μL/（min·kg）的2倍。肝臟內(nèi)膽汁與膽囊膽汁組間比較基本一致，420 nm處的吸光度（對應于黃色）Cldn2-/-組顯著高于Cldn2+/+組，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組膽汁成分比較分析見表1，結(jié)果顯示Cldn2-/-組膽汁中總膽固醇、磷脂、非酯化脂肪酸總膽汁酸及總膽紅素均顯著高于Cldn2+/+組（P＜0.01）。這些結(jié)果表明Cldn2基因敲除降低膽汁流速、提高膽汁脂質(zhì)濃縮比。

圖1 Cldn2+/+組與Cldn2-/-組膽囊及肝內(nèi)膽汁宏觀比較

表1 Cldn2+/+組與Cldn2-/-組肝內(nèi)膽汁成分分析

2.2 Cldn2基因敲除會降低肝內(nèi)膽管單位（IBDU）的跨膜滲透壓

將Cldn2+/+組的IBDU置于低滲緩沖液中，腔內(nèi)空間立即增加且持續(xù)至90 s；相反，當IBDU置于高滲緩沖液中時，Cldn2+/+組腔內(nèi)空間立即降低并且持續(xù)收縮至90 s。與Cldn2+/+組比，90 s時Cldn2-/-組具有與其相同的變化趨勢，但變化幅度顯著低于Cldn2+/+組，低滲時[（1.20±0.02）%vs（1.34±0.02）%，P=0.035]，高滲時[（0.67±0.01）%vs（0.82±0.01）%，P=0.025]。見圖2

2.3 Cldn2基因敲除降低跨上皮電傳導

對膽汁及血清內(nèi)的離子濃度分析見表2，結(jié)果顯示：血清、肝內(nèi)膽汁以及膽囊膽汁中，Cldn2-/-組膽汁中Na+低于Cldn2+/+組，K+濃度稍微高于Cldn2+/+組，跨上皮電傳導顯示Cldn2-/-組的膽管傳導速度顯著降低，分別為（7.9±0.5）ms/cm2、 （18.6±1.2）ms/cm2，提示膽管內(nèi)離子的滲透降低。

圖2 Cldn2-/-組與Cldn2+/+組低滲與高滲條件下跨膜滲透壓比較

表2 Cldn2+/+組與Cldn2-/-組膽汁及血清內(nèi)的離子濃度比較

2.4 Cldn2基因敲除增強膽固醇結(jié)石形成傾向

經(jīng)過為期4周的致石飲食處理，所有Cldn2-/-組均宏觀可見膽固醇結(jié)石形成，膽固醇結(jié)石形成比例100%，而Cldn2+/+組中僅1例見結(jié)石形成；8周后觀察Cldn2+/+組中接近一半小鼠（7例/46.7%）有結(jié)石形成。顯微鏡下觀察，Cldn2-/-組膽汁中微小結(jié)晶數(shù)顯著增加（P＜0.001）。

表3 Cldn2+/+組與Cldn2-/-組膽固醇結(jié)石形成風險比較

3 討論

本研究的結(jié)果顯示，肝膽管細胞中Cldn2基因的異常缺乏可影響細胞旁滲透途徑，調(diào)控膽汁的成分和分泌量，增加膽結(jié)石形成的易感性。通常情況下膽汁酸自肝細胞分泌至膽小管內(nèi)，并且在經(jīng)過膽管和膽囊的過程中被修飾而形成最終的膽汁[7-9]。從血流中攝取或肝細胞產(chǎn)生的膽汁酸與其他有機陰離子通過肝細胞頂端的細胞膜轉(zhuǎn)運至小管腔內(nèi)，這些溶質(zhì)集中在小管腔內(nèi)并形成滲透壓，誘導水分子跨上皮轉(zhuǎn)運至膽小管中形成膽汁流。膽管細胞分泌HCO3-、Cl-并且重新收膽汁酸、谷氨酸、葡萄糖和其他分子，膽汁在流經(jīng)肝內(nèi)膽管期間通過調(diào)節(jié)分泌和重吸收對水分含量進行控制。而本研究發(fā)現(xiàn)Cldn2基因的表達缺失會導致膽汁流經(jīng)肝內(nèi)膽管時Na+、K+濃度降低，跨膜滲透壓減少，水分子的跨上皮轉(zhuǎn)運過程受到抑制。

目前研究認為膽固醇結(jié)石的發(fā)病受多種因素影響的，包括遺傳和環(huán)境因素，但水分的降低和膽固醇濃度過飽和是膽固醇結(jié)晶核化的關鍵因素。通常情況下水分子的跨上皮運輸存在兩種途徑[10-12]，即通過轉(zhuǎn)運蛋白的跨細胞途徑及通過細胞之間緊密連接的細胞旁途徑。研究發(fā)現(xiàn)：肝膽系統(tǒng)中水分子的跨細胞途徑是通過水通道蛋白（AQP）完成的，嚙齒動物肝細胞主要表達AQP0、AQP8及AQP9，AQP8，位于細胞內(nèi)囊泡和小管質(zhì)膜，參與小管水分泌；AQP9則主要位于基底外側(cè)質(zhì)膜，這種分布特點有利于水分自跨細胞途徑輸送至小管腔內(nèi)[13-15]。膽管細胞表達AQP1及AQP4，AQP1缺失可降低膽管細胞中水分子的滲透性，但是對膽汁的流動性幾乎沒有影響。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)Cldn2-/-組雖然也會表現(xiàn)出膽汁流動，但流速僅為Cldn2+/+組的一半，提示Cldn2基因并不直接影響水通道蛋白的表達和功能從減少膽汁酸的形成。由于膽汁酸和有機陰離子是膽汁流動的主要驅(qū)動力[16-19]，Cldn2基因正是通過影響膽汁酸中的離子濃度，進而改變膽汁酸形成過程中的跨膜滲透壓，間接影響水分子的細胞旁轉(zhuǎn)運過程，最終表現(xiàn)為Cldn2-/-小鼠膽汁流動受阻，膽固醇結(jié)石的形成。

Cldn2是第一個也是研究最多的緊密連接蛋白，通過形成陽離子選擇通道，增加細胞旁陽離子滲透[20]。腎臟中Cldn2缺失導致小鼠近端小管的陽離子選擇性喪失，并且細胞旁抗性增加和陽離子選擇性障礙導致NaCl的嚴重缺失。這在本研究中也得到了相應的證實，Cldn2-/-小鼠膽汁中脂質(zhì)和膽汁酸濃度更高，而Na+稍微低于Cldn2+/+小鼠，導致Cldn2-/-小鼠中跨上皮電傳導速度顯著降低，提示Cldn2基因敲除后可能通過降低陽離子的滲透性導致膽汁的流動減弱。

當前的結(jié)果提供了一種新的膽汁酸微循環(huán)模型，Cldn2的不均勻分布有利于肝臟內(nèi)的血液與膽管之間物質(zhì)的交換和運輸：由于Cldn2在周圍區(qū)域中表達量較高，因此水分子進入膽小管主要發(fā)生于該區(qū)域；基底外側(cè)質(zhì)膜的周圍區(qū)域中AQP9的高表達亦有利于水分子的跨膜轉(zhuǎn)運。加之膽小管是一個盲端結(jié)構(gòu)，局部高效率的水分子轉(zhuǎn)運使得更多的水分集中在膽小管起始處，促進了膽汁的平滑流動。

綜合本研究初步結(jié)果，我們認為：膽汁的成分和分泌量在一定程度上受Cldn2缺失引起的細胞旁分泌方式的水滲透途徑的調(diào)節(jié)，這為預防膽結(jié)石疾病提供了新的靶點。