李雪川，崔旭雅，李霖，楊洋，巴桑，鄂福勝，趙銘寧

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 普外科，上海 200092；2.西藏自治區(qū)日喀則市人民醫(yī)院 普外科，西藏 日喀則 857000）

膽囊癌是最常見的膽道系統(tǒng)腫瘤，由于起病前期缺乏特異的臨床癥狀，患者確診時(shí)多處于腫瘤進(jìn)展期。膽囊癌整體5年生存率不足5%，預(yù)后極差[1-4]。因此，尋找膽囊癌診斷與治療新的分子靶點(diǎn)，尋找與膽囊癌預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)記物，對(duì)改善膽囊癌目前的診治現(xiàn)狀至關(guān)重要。PIK3R3蛋白是磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）的調(diào)節(jié)亞基，已有報(bào)道其在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如乳腺癌、胃癌、直腸癌、肺癌等；且異常高表達(dá)的PIK3R3蛋白具有促進(jìn)腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、抵抗化療療效的功能[5-9]。前期我們?cè)谀懩野┘?xì)胞系中利用miRNA敲減PIK3R3后，發(fā)現(xiàn)膽囊癌細(xì)胞的生長、遷移明顯受到抑制，提示其可能在膽囊癌的發(fā)生發(fā)展中也有一定的作用[10]。故本文探究PIK3R3在膽囊癌組織的表達(dá)情況以及其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以評(píng)估其是否可作為判斷膽囊癌預(yù)后的一個(gè)分子標(biāo)志物。

1 資料和方法

1.1 一般資料

本研究共納入50對(duì)膽囊癌標(biāo)本，均具有完整的臨床及病理資料，且病理結(jié)果為膽囊腺癌。術(shù)前未行放化療等其他治療。其中男20例，女30例，年齡45～80歲，平均62.8歲，伴膽囊結(jié)石35例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例。根據(jù)第九版美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）膽囊癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，0～I(xiàn)期患者9例，II～I(xiàn)V期患者41例。根據(jù)Edmondson標(biāo)準(zhǔn)，高分化患者10例，中分化患者19例，低分化患者21例；癌和癌旁組織均在手術(shù)切除后立即采取，一份放置于液氮中保存，另一份則經(jīng)福爾馬林固定后石蠟包埋。本研究通過我院倫理委員會(huì)審批，所有入組患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

鼠抗人PIK3R3單克隆抗體購自美國Abcam公司；山羊抗鼠IgG（稀釋濃度1:100）、通用型SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒和super signal發(fā)光試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

免疫組織化學(xué)染色檢測：切片著色程度通過半定量的方式記分：0分，未染色；1分，弱染色，2分，中等程度染色；3分，強(qiáng)染色。著色細(xì)胞百分率記分為：0分，少于5%；1分，5%～25%；2分，25%～50%；3分，＞50%。將每張切片平均著色程度得分與平均著色細(xì)胞百分率得分各自相加為其最后得分：0分為陰性，1～2分為弱陽性，3分為陽性，4～6分為強(qiáng)陽性。將陽性和強(qiáng)陽性定義為陽性，陰性和弱陽性定義為陰性。

1.4 隨訪

采用門診隨訪或電話隨訪的方式進(jìn)行隨訪；總生存期定義為從確診膽囊腫瘤起至死亡的時(shí)間或隨訪結(jié)束時(shí)的時(shí)間。隨訪時(shí)間截止至2018年12月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用Pearsonχ2檢驗(yàn)、矯正χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法。計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)比較。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-Rank法檢驗(yàn)總體生存率的差異。采用單因素與多因素Cox回歸分析建立膽囊癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽囊癌及癌旁組織中PIK3R3表達(dá)情況

PIK3R3蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)；膽囊癌中其表達(dá)陽性反應(yīng)變現(xiàn)為棕黃色或棕褐色的染色均一的顆粒（圖1B），表達(dá)陽性率74.0%（37例），癌旁組織中很少檢測到陽性表達(dá)，表達(dá)陽性率28.0%（14例） （圖1A），兩者陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.923，P＜0.05），見表1。

圖1 癌旁組織及癌組織中PIK3R3表達(dá)情況（免疫組化，×20）

2.2 PIK3R3蛋白表達(dá)與患者臨床病例特征之間的關(guān)系

為進(jìn)一步分析PIK3R3蛋白表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系，我們收集了患者的臨床信息。發(fā)現(xiàn)在患者的性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和膽囊結(jié)石等方面，膽囊癌組織中PIK3R3蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而在腫瘤的TNM分期和分化程度方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 PIK3R3蛋白表達(dá)陽性率與患者臨床特征之間的關(guān)系

2.3 膽囊癌組織中PIK3R3蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

為了探究PIK3R3蛋白在膽囊癌組織中的異常高表達(dá)是否影響患者預(yù)后。我們以PIKR3蛋白表達(dá)的不同將患者分為兩組繪制生存曲線可見，PIK3R3蛋白表達(dá)陰性的膽囊癌患者（n=13）的中位生存時(shí)間為19個(gè)月，PIK3R3蛋白表達(dá)陽性的膽囊癌患者（n=37）的中位生存時(shí)間為10個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

2.5 單因素及多因素Cox回歸分析

圖2 PIK3R3蛋白陽性表達(dá)與陰性表達(dá)對(duì)膽囊癌患者生存時(shí)間的影響

利用單因素Cox回歸分析，將患者性別、年齡、TNM分期、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及膽囊結(jié)石納入分析，結(jié)果如表2所示：TNM分期及PIK3R3表達(dá)陽性可作為膽囊癌患者總體預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素之一；取P＜0.05的風(fēng)險(xiǎn)因素，及TNM分期及PIK3R3蛋白的表達(dá)情況納入進(jìn)一步分析。進(jìn)行多因素分析多變量Cox回歸后，結(jié)果顯示：PIK3R3表達(dá)陽性可作為膽囊癌患者總體預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素（HR5.765，95%CI1.843～18.033，P＜0.05）。

3 討論

PI3Ks包括一個(gè)調(diào)節(jié)亞基和一個(gè)催化亞基，分別由不同基因編碼。大量研究已經(jīng)證實(shí)，PI3K信號(hào)通路在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都發(fā)揮了重要的作用，同時(shí)也有越來越多的研究關(guān)注到PI3K家族中的一員—PIK3R3在腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及化療效果抵抗等方面的作用，包括胃癌、腸癌、乳腺癌等。Xia X等[11]、Wang G等[12]的研究結(jié)果表明，PIK3R3主要通過其NH2末端與RBI、PCNA相互作用發(fā)揮癌基因功能；同時(shí)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，利用PIK3R3特異抑制劑Ad-N24可以抑制動(dòng)物模型的腫瘤轉(zhuǎn)移。Peng等[6]研究發(fā)現(xiàn)，PIK3R3可以通過ZEB1介導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化提升胰腺癌的轉(zhuǎn)移。這些研究證實(shí)了PIK3R3在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。但是PIK3R3蛋白在膽囊癌中的相關(guān)作用罕有報(bào)道。前期我們利用miRNA在膽囊癌細(xì)胞中敲減PIK3R3后，發(fā)現(xiàn)膽囊癌的增殖及轉(zhuǎn)移能力均有所下降，提示在細(xì)胞學(xué)水平PIK3R3在膽囊癌的發(fā)生發(fā)展中有所作用，但其在膽囊癌中的臨床意義仍不明確。

為了探究PIK3R3蛋白與患者臨床特征及預(yù)后之間的關(guān)系，我們利用免疫組織化學(xué)技術(shù)比較了50對(duì)膽囊癌患者的癌和癌旁組織中PIK3R3蛋白的表達(dá)，并對(duì)所有患者進(jìn)行了隨訪。結(jié)果表明：PIK3R3主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，膽囊癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這與PIK3R3在其他腫瘤中報(bào)道的作為癌基因發(fā)揮促癌作用及多在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)相一致；我們進(jìn)一步分析了PIK3R3蛋白的表達(dá)與患者臨床特征之間的關(guān)系，以期探尋其是否可以作為臨床診斷的輔助指標(biāo)。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示PIK3R3表達(dá)陽性與TNM分期及腫瘤分化有關(guān)，而與性別、年齡、是否患者膽囊結(jié)石等無關(guān)，這提示PIK3R3可能參與了膽囊癌的發(fā)生發(fā)展，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲可能相關(guān)。進(jìn)一步通過繪制生存曲線表及Log-Rank分析顯示，PIK3R3表達(dá)陽性的患者預(yù)后更差。為了進(jìn)一步排除混雜因素的影響，我們建立了膽囊癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型。單因素Cox回歸分析顯示，患者的TNM分期及PIK3R3蛋白的表達(dá)情況與預(yù)后相關(guān)，繼而將這兩種因素納入Cox多因素回歸分析顯示兩者均可影響患者的預(yù)后。但是就統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果而言，PIK3R3的異常表達(dá)對(duì)于患者預(yù)后的影響比患者腫瘤的TNM分期更大，這也說明了PIKER3表達(dá)陽性可作為判斷患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素之一，且有可能是較為重要的危險(xiǎn)因素。

表2 臨床病理特征與患者預(yù)后的單因素及多因素Cox回歸分析

綜上所述，PIK3R3在膽囊癌中高表達(dá)，與膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。膽囊癌組織中PIK3R3表達(dá)陰性者的預(yù)后優(yōu)于表達(dá)陽性者，其表達(dá)水平可作為膽囊癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)。然而，對(duì)于PIK3R3在膽囊癌中作用的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，以期為探膽囊癌的綜合治療提供新的思路，為改善膽囊癌患者的預(yù)后提供新的方向。