鄭 潔， 徐曉薇， 張新杰， 王學(xué)韜， 鄒倩倩， 舒劍波， 蔡春泉

肢帶型肌營養(yǎng)不良(Limb-girdle muscular dystrophy,LGMD) 是一組以進(jìn)行性骨盆帶和肩胛帶肌無力為臨床特點(diǎn)的常染色體遺傳性疾病[1]。2018年歐洲神經(jīng)肌肉疾病中心提出新的命名方式[2]，將LGMD分為29種亞型，LGMD D1到LGMD D5為常染色體顯性遺傳；LGMD R1到LGMD R24為常染色體隱性遺傳，這些亞型大多與嚴(yán)重先天性肌營養(yǎng)不良相關(guān)的基因缺陷有關(guān)[3～5]。2A型肢帶型肌營養(yǎng)不良(Limb-girdle muscular dystrophy,LGMD2A)又稱LGMD R1 calpain3-related，是最常見的亞型之一，占LGMD總數(shù)的30%，發(fā)病率約1/10萬，平均發(fā)病年齡17.9歲，由CAPN3基因缺陷導(dǎo)致[6,7]。主要臨床表現(xiàn)為近端肌肉無力、肌萎縮，伴翼狀肩、肌酸激酶升高等。該病臨床表現(xiàn)差異大，臨床表現(xiàn)與X染色體連鎖的杜氏/貝氏進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良相似，易誤診。目前，肌肉鈣蛋白酶-3的缺乏和進(jìn)一步的CAPN3基因檢測為確診該病的主要方法。在本研究中，使用全外顯子測序方法對(duì)1個(gè)2A型肢帶型肌營養(yǎng)不良家系進(jìn)行基因分析以明確病因，為該家系的遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 先證者(Ⅱ11)，男，現(xiàn)58歲。出生時(shí)為足月順產(chǎn)，9歲出現(xiàn)下蹲費(fèi)力，跑跳困難。19歲出現(xiàn)走路易跌倒，上樓梯需要扶椅，鴨步步態(tài)，雙肩抬舉費(fèi)力。32歲時(shí)仍能夠行走，在他人攙扶下可上樓；同年在外院行血液生化檢查：血清肌酸激酶560 U/L(正常參考值50～170 U/L)，乳酸脫氫酶98 U/L(正常參考值120～250 U/L)，谷草轉(zhuǎn)氨酶正常；體格檢查：閉眼無力，三角肌、肱二頭肌和肱三頭肌肌力均為3級(jí)；髂腰肌、股四頭肌、腓腸肌和脛骨前肌肌力均為2級(jí)，腓腸肌無肥大，其余未見異常。肌電圖提示肌源性受損；診斷為肢帶型肌營養(yǎng)不良。46歲時(shí)跌倒致一側(cè)脛腓骨骨折，后使用輪椅。父母非近親結(jié)婚，有家族遺傳史：先證者的二姐(Ⅱ5)和三姐(Ⅱ7)有類似病史，先證者二姐(Ⅱ5)現(xiàn)使用輪椅，可在他人攙扶下行走；先證者三姐(Ⅱ7)現(xiàn)使用輪椅，無法行走。先證者兄長和姐姐均已婚，子女均無發(fā)病。先證者父親(Ⅰ1)和長姐(Ⅱ1)已死亡(見圖1)。先證者女兒(Ⅲ7)有再次生育愿望，遂來我院行遺傳咨詢，進(jìn)行家系基因篩查。本研究獲得家系成員的知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方 法

1.2.1 樣本 采集收集先證者及其家族成員外周靜脈血2 ml于EDTA抗凝管中，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂每禐槭兰o(jì)生物公司的血液基因組提取試劑盒提取基因組DNA，DNA體積100 μl，濃度達(dá)10 ng/μl以上，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 全外顯子測序 抽取先證者外周血樣1 ml，委托深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行全外顯子組高通量測序。測序原始數(shù)據(jù)使用BWA軟件與hg19人類參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，采用GATK 軟件進(jìn)行插入缺失、單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)等分析，用Annovar軟件和千人基因組數(shù)據(jù)庫、dbSNP、OMIM等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，利用Polyphen2和SIFT等軟件進(jìn)行蛋白功能預(yù)測。

1.2.3 Sanger測序驗(yàn)證 根據(jù)全外顯子測序結(jié)果，采用Sanger測序?qū)ο茸C者及其家系成員進(jìn)行驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增家系中其余2例患者和正常家系成員基因。針對(duì)CAPN3基因c.1194-9A>G(NM_000070.2)突變?cè)O(shè)計(jì)引物，上游引物為5’-GCCACCCTCTTTTCATCCTCC-3’，下游引物為5’-TGTTCCCACAGTTTCCTGCTTC-3’，Tm值為58 ℃。針對(duì)CAPN3基因c.1437C>T(NM_000070.2)突變?cè)O(shè)計(jì)引物，上游引物為5’-TGTAGGGAATAGAAATAAATGG-3’，下游引物為5’-CCAGGAGCTCTGTGGGTCA-3’，Tm值為60 ℃。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 30 s，58 ℃/60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用康為世紀(jì)生物公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化DNA后，送至北京金唯智生物科技公司進(jìn)行Sanger測序。測序結(jié)果用Chromas軟件與GenBank中參考序列比對(duì)，確定突變位點(diǎn)。應(yīng)用在線軟件Human Splicing Finder(http://www.ummd.be/HSF/)進(jìn)行基因剪接位點(diǎn)預(yù)測。

2 結(jié) 果

2.1 全外顯子測序結(jié)果 結(jié)果顯示先證者CAPN3(NM_000070.2)基因存在復(fù)合雜合突變。第9內(nèi)含子存在c.1194-9A>G雜合突變，生成一個(gè)剪切位點(diǎn)突變。在第5外顯子上存在另一個(gè)雜合突變，c.1437C>T(p.ser479=),第479位的遺傳密碼子由AGC變成AGT，氨基酸絲氨酸未發(fā)生改變的同義突變。檢索ClinVar數(shù)據(jù)庫，c.1194-9A>G變異為已經(jīng)報(bào)道過的致病性變異；c.1437C>T(p.ser479=)變異未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，該變異為新突變。

2.2 Sanger測序驗(yàn)證結(jié)果 Sanger測序結(jié)果與全外顯子測序結(jié)果一致。結(jié)果顯示先證者(Ⅱ11)CAPN3基因c.1194-9A>G變異來源于母親(Ⅰ2)，c.1437C>T(p.ser479=)未在母親測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)。家族中患者(Ⅱ5、Ⅱ7)也存在相同的復(fù)合雜合突變，其四姐(Ⅱ9)和女兒(Ⅲ7)為c.1194-9A>G變異攜帶者，先證者的女婿(Ⅲ8)未檢測到上述位點(diǎn)變異(見圖2)。

2.3 生物信息學(xué)分析 應(yīng)用在線軟件Human Splicing Finder(http://www.ummd.be/HSF/)評(píng)估該變異可能影響剪切，產(chǎn)生新的剪接位點(diǎn)(見圖3)。

A:先證者母親(Ⅰ2)存在c.1194-9A>G雜合變異；B:先證者二姐(Ⅱ5)存在c.1194-9A>G和c.1437C>T的復(fù)合雜合突變；C:先證者三姐(Ⅱ7)存在c.1194-9A>G和c.1437C>T的復(fù)合雜合突變；D:先證者四姐(Ⅱ9)存在c.1194-9A>G雜合變異；E：先證者(Ⅱ11)存在c.1194-9A>G和c.1437C>T的復(fù)合雜合突變；F：先證者女兒(Ⅲ7)存在c.1194-9A>G雜合變異；G：先證者女婿(Ⅲ8)無該位點(diǎn)變異

圖1 先證者家系圖

圖2 CAPN3基因兩個(gè)突變位點(diǎn)的Sanger測序結(jié)果

圖3 生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果圖

3 討 論

LGMDs是一組累及近端肌肉，主要表現(xiàn)為骨盆帶肌和肩胛帶肌無力的常染色體遺傳性疾病。發(fā)病率約1/10萬，從2歲至55歲均可發(fā)病，平均發(fā)病年齡17.9歲?；颊咦园l(fā)病至依賴輪椅的平均病程為15.2 y，平均年齡為35.2歲[6]。該病具有高度異質(zhì)性，肌無力的進(jìn)展通常是對(duì)稱性的，但病情嚴(yán)重程度各不相同[8]。LGMD2A的主要臨床特點(diǎn)是進(jìn)行性肌無力，可表現(xiàn)為跑跳困難、翼狀肩、異常步態(tài)等，在病程晚期可有呼吸肌受累導(dǎo)致呼吸衰竭[9,10]。該病的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、肌肉活組織病理學(xué)檢查以及基因檢測確定突變，這同時(shí)也是進(jìn)行遺傳咨詢的關(guān)鍵[11]。

LGMD遺傳模式分為常染色體隱性遺傳和常染色體顯性遺傳，最常見的LGMD2A型是由CAPN3基因突變引起的常染色體隱性遺傳病[12]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了約500個(gè)變異，也有報(bào)道CAPN3基因內(nèi)21個(gè)堿基對(duì)缺失可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳[5]。CAPN3基因位于染色體15q15區(qū)，該基因由24個(gè)外顯子組成，編碼的產(chǎn)物為calpain3[13]。Calpain由821個(gè)氨基酸組成，是一種肌肉特異性非溶酶體半胱氨酸蛋白酶，參與肌肉再生、肌膜重構(gòu)、細(xì)胞骨架調(diào)控和鈣穩(wěn)態(tài)，與多種關(guān)鍵骨骼肌蛋白的分解和裂解相關(guān)，尤其是與肌原纖維蛋白骨架構(gòu)成相關(guān)的蛋白，例如肌聯(lián)蛋白、細(xì)絲蛋白C、黏著斑蛋白等[14～16]。CAPN3基因突變導(dǎo)致這些蛋白活性的喪失，與LGMD2A的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

本研究中，先證者9歲起病，以骨盆帶肌受累為主，出現(xiàn)下蹲費(fèi)力、跑跳困難，無翼狀肩和腓腸肌肥大，血清肌酸激酶升高，肌電圖提示肌源性受損。先證者于20余年前被診斷為貝氏進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良，但是根據(jù)家系調(diào)查研究，本家系在Ⅱ代中出現(xiàn)了2名女性患者，后一代男性均無患者，不符合X連鎖隱性遺傳的遺傳模式。全外顯子測序結(jié)果顯示先證者CAPN3基因存在一個(gè)已知的致病變異c.1194-9A>G，同時(shí)檢測到另一同義突變c.1437C>T(p.ser479=)，該同義突變?cè)谇嘶蚪M及gnomAD數(shù)據(jù)庫中，東亞人群的頻率為3‰和2.5‰，全人群的頻率為6‰和1‰，不屬于SNP位點(diǎn)。故結(jié)合其臨床表現(xiàn)和病史，可確診為LGDM2A。利用Sanger測序?qū)易宄蓡T進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)家族中患者(Ⅱ5、Ⅱ7)存在相同的復(fù)合雜合突變， c.1194-9A>G變異來源于先證者母親，其四姐(Ⅱ9)和女兒(Ⅲ7)為c.1194-9A>G變異攜帶者。1194-9A>G突變導(dǎo)致新的剪接位點(diǎn)位于正常位點(diǎn)的下游9 bp處，使得第9內(nèi)含子最后8個(gè)堿基得以保留，產(chǎn)生一個(gè)新的增強(qiáng)子，這與第7內(nèi)含子中Alu元件的多次插入有關(guān)，使得轉(zhuǎn)錄本中前7個(gè)外顯子缺失[17]。c.1437C>T(p.ser479=)變異在家族中患者(Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅱ11)均攜帶，根據(jù)美國ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南[18]，該變異符合致病性證據(jù)PM2:ESP數(shù)據(jù)庫、千人數(shù)據(jù)庫、EXAC數(shù)據(jù)庫中正常對(duì)照人群中未發(fā)現(xiàn)的變異；PM3:在隱性遺傳病中,在反式位置上檢測到致病變異，并已通過患者父母驗(yàn)證;PP1：突變與疾病在家系中共分離；PP3：預(yù)測該變異可能影響剪切；PP4：變異攜帶者的表型或家族史高度符合某種單基因遺傳疾病。符合“2個(gè)中等(PM2、PM3)和≥2個(gè)支持(PP1、PP3、PP4)”，根據(jù)以上證據(jù)認(rèn)為該變異為可能致病的。

綜上所述，本研究中我們對(duì)一個(gè)LGMD2A型的家系進(jìn)行基因突變的分析，發(fā)現(xiàn)先證者存在CAPN3基因c.1194-9A>G和c.1437C>T(p.ser479=)的復(fù)合雜合突變，通過家系研究及生物信息學(xué)預(yù)測，初步證實(shí)了c.1437C>T(p.ser479=)為一導(dǎo)致剪接位點(diǎn)突變的新突變，豐富了CAPN3基因的突變譜，為基因診斷和遺傳咨詢提供了依據(jù)。