孫靖玉 林雅軍 (北京醫(yī)院國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心 衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

激酶非催化C-葉結(jié)構(gòu)域蛋白(KNDC)1又稱V-KNDC1(KIND)、RASGEF2、C10orf23、Very-KIND、bB439H18.3，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新基因，在腦的不同區(qū)域表達(dá)水平不同，尤其在小腦顆粒細(xì)胞中表達(dá)最高〔1〕。其在許多信號(hào)傳導(dǎo)通路的蛋白間分子識(shí)別和功能調(diào)控中扮演重要角色〔2〕。研究表明，KNDC1與神經(jīng)元樹(shù)突的生長(zhǎng)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的衰老及纖維核心蛋白的修飾有關(guān)，有望成為新的研究熱點(diǎn)。本文將 KNDC1 這一新調(diào)控因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與其功能作用及其機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 KNDC1概況

1.1KNDC1的發(fā)現(xiàn) KIND從催化蛋白激酶折疊進(jìn)化成用于信號(hào)蛋白的潛在蛋白質(zhì)相互作用模塊。 Spir家族肌動(dòng)蛋白和13型非受體磷酸酶(PTP 13型)在蛋白質(zhì)的very-N-末端部分編碼KIND結(jié)構(gòu)域。Mees等〔3〕報(bào)道了KIND蛋白家族第三個(gè)成員的表征和克隆，由于其含有兩個(gè)KIND結(jié)構(gòu)域，將其命名為very-KIND(V-KIND)。其后，Huang等〔4〕也報(bào)道了KNDC1對(duì)神經(jīng)元樹(shù)突生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的機(jī)制。

1.2KNDC1的分布 哺乳動(dòng)物基因組中只有一個(gè)V-KIND基因，到目前為止只在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了該基因。為確定所有編碼蛋白質(zhì)基因的組織特異性，對(duì)代表27種不同組織的95個(gè)人類個(gè)體的組織樣本進(jìn)行RNA-seq檢測(cè)〔5〕，結(jié)果顯示KNDC1在腦、卵巢、腎上腺、子宮內(nèi)膜、睪丸、甲狀腺等均有表達(dá)。Mees等〔3〕發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎發(fā)生過(guò)程中，V-KIND基因在發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)中特異性表達(dá)。在成年小鼠中，V-KIND僅在腦中高表達(dá)，在卵巢中可以檢測(cè)到低表達(dá)。V-KIND主要在小腦顆粒和浦肯野細(xì)胞層的神經(jīng)元細(xì)胞中特異性表達(dá)。李開(kāi)濟(jì)等〔2〕在人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞中也檢測(cè)到KNDC1的表達(dá)。

1.3KNDC1的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 人KNDC1基因位于10q26.3，長(zhǎng)約65 959 bp，共有4個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體，其中變異體1最長(zhǎng)，翻譯后的蛋白質(zhì)分子量約為54 191 kD，在239個(gè)有機(jī)體中具有人類基因KNDC1，其在恒河猴、小鼠、大鼠、雞和青蛙中保守性很強(qiáng)。KIND是公認(rèn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用模塊。迄今為止，發(fā)現(xiàn)的含KIND的蛋白質(zhì)有4種，肌動(dòng)蛋白 -核因子(Spir-2)，蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPN13)，支架蛋白(FRMPD2)和V-KIND(腦特異性Ras鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子)。 其中V-KIND有2個(gè)KIND域(KIND1和KIND2)，而其他3個(gè)蛋白只有一個(gè)〔6〕。與蛋白質(zhì)家族的其他成員一樣，V-KIND在N末端具有KIND結(jié)構(gòu)域。第2個(gè)KIND結(jié)構(gòu)域位于蛋白質(zhì)的中心部分。 C-末端半編碼Ras樣GTP酶(RasGEF)和RasGEF N-末端模塊(RasGEFN)的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子結(jié)構(gòu)示意圖如圖1。

圖1 KNDC1結(jié)構(gòu)

2 KNDC1與神經(jīng)元樹(shù)突的生長(zhǎng)

大腦特異性RasGEF V-KIND 是小腦顆粒細(xì)胞正常樹(shù)突生長(zhǎng)和適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)所必須的。

2.1KNDC1負(fù)調(diào)控神經(jīng)元樹(shù)突的生長(zhǎng) V-KIND過(guò)表達(dá)和RNAi敲低實(shí)驗(yàn)表明，V-KIND在控制樹(shù)突生長(zhǎng)中有重要作用，盡管潛在的分子機(jī)制仍然難以闡明〔1，6〕。前期研究表明，V-KIND的 RasGEF活性通過(guò)c-JUN氨基末端激酶(JNK)1和(或)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶(ERK)，經(jīng)由 Ras-Raf-MAPK通路誘導(dǎo)微管關(guān)聯(lián)蛋白(MAP)2的磷酸化，MAP2磷酸化后與微管結(jié)合的活性增加，可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞樹(shù)突的長(zhǎng)度增加，研究還發(fā)現(xiàn)抑制或敲低V-KIND的表達(dá)可以促進(jìn)培養(yǎng)中的小腦顆粒細(xì)胞和海馬神經(jīng)元的樹(shù)突生長(zhǎng)，這表明其作為一種信號(hào)分子在發(fā)育過(guò)程中調(diào)控或抑制神經(jīng)元樹(shù)突生長(zhǎng)〔7〕。同時(shí)，KNDC1基因敲除小鼠運(yùn)動(dòng)功能沒(méi)有顯著變化，但年輕的基因敲除小鼠的握力有明顯增加，且在平衡相關(guān)試驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)操作性能展現(xiàn)出更好的趨勢(shì)。

2.2KNDC1調(diào)控樹(shù)突的生長(zhǎng)的機(jī)制 最初研究假設(shè)KNDC1調(diào)控樹(shù)突的生長(zhǎng)機(jī)制可能是V-KIND和MAP2之間的物理和功能關(guān)聯(lián)，即V-KIND-MAP2相互作用和V-KIND誘導(dǎo)的MAP2 Thr磷酸化。MAP2是一種樹(shù)突狀微管相關(guān)蛋白，在神經(jīng)元樹(shù)突生長(zhǎng)中起負(fù)調(diào)控作用。在樹(shù)突發(fā)展過(guò)程中，早期的樹(shù)枝狀伸長(zhǎng)和后期的樹(shù)枝狀成熟都需要正常的MT結(jié)構(gòu)。 MAP2磷酸化水平在發(fā)育上受到樹(shù)突生長(zhǎng)的控制〔8，9〕。 MAP2的磷酸化增加造成MAP2從MT分離，從而導(dǎo)致MT穩(wěn)定性降低和肌動(dòng)蛋白束活性減弱〔10～14〕。Huang等〔4〕研究顯示V-KIND過(guò)表達(dá)促進(jìn)MAP2 Thr磷酸化并導(dǎo)致樹(shù)突生長(zhǎng)受損，而V-KIND RNAi敲低降低MAP2 Thr磷酸化并誘導(dǎo)樹(shù)突生長(zhǎng)增加。此外，MAP2結(jié)合結(jié)構(gòu)域KIND2單獨(dú)作為顯著的負(fù)調(diào)控因子，其過(guò)表達(dá)最終增加樹(shù)突長(zhǎng)度和復(fù)雜性。以上表明V-KIND可能通過(guò)在樹(shù)突發(fā)育過(guò)程中控制MAP2磷酸化水平起作用。見(jiàn)圖2。

圖2 KNDC1調(diào)控樹(shù)突生長(zhǎng)的機(jī)制

Huang等〔4〕通過(guò)生成一系列突變構(gòu)建體來(lái)分析v-KIND-MAP2相互作用的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。在4種含KIND的蛋白質(zhì)(Spir-2，PTPN13，F(xiàn)RMPD2和V-KIND)中的KIND結(jié)構(gòu)域中，只有V-KIND的KIND2結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合MAP2。 值得注意的是，在海馬神經(jīng)元中表達(dá)的32個(gè)殘基的V-KIND MAP2結(jié)合核心多肽在促進(jìn)樹(shù)突分支方面非常有效，這與V-KIND過(guò)表達(dá)的效果相反，但類似于V-KIND的敲低效應(yīng)〔14〕，表明32個(gè)氨基酸核心多肽通過(guò)與內(nèi)源性V-KIND競(jìng)爭(zhēng)MAP2結(jié)合位點(diǎn)而充當(dāng)顯性負(fù)調(diào)節(jié)分子。先前的體外研究表明，V-KIND的RasGEF活性通過(guò)激活Ras-Raf-MAP激酶途徑誘導(dǎo)JNK1和(或)ERK促進(jìn) MAP2 磷酸化〔7〕。JNK1對(duì)MAP2的磷酸化作用(如V-KIND過(guò)表達(dá)的下游〔14〕)增強(qiáng)了MAP2與微管的結(jié)合并促進(jìn)其組裝的活性〔15〕，并且對(duì)JNK1的抑制(如V-KIND 敲低下游〔14〕)增加了樹(shù)突分支的數(shù)量，但縮短了樹(shù)突的平均長(zhǎng)度〔16〕。對(duì)V-KIND-MAP2相互作用關(guān)鍵的結(jié)合核心模塊定義在小鼠V-KIND KIND2的32個(gè)殘基內(nèi)和小鼠MAP2中心結(jié)構(gòu)域的43個(gè)殘基內(nèi)。 KIND2的MAP2結(jié)合核心模塊中氨基酸461、474和477處的3個(gè)Leu殘基促成了相互作用。 MAP2結(jié)合核心模塊本身作為海馬神經(jīng)元中V-KIND的顯性負(fù)調(diào)節(jié)因子促進(jìn)樹(shù)突分支。綜上，KIND2結(jié)構(gòu)域通過(guò)V-KIND RasGEF(Ras途徑的激活劑)靶向與樹(shù)突微管細(xì)胞骨架相關(guān)的MAP2結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)樹(shù)突復(fù)雜性。

總之，V-KIND和MAP2相互作用核心模塊在調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元和小腦顆粒細(xì)胞樹(shù)突生長(zhǎng)和分支的結(jié)構(gòu)和功能上起重要作用。對(duì)這些新鑒定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用核心模塊的進(jìn)一步研究，包括三級(jí)結(jié)構(gòu)分析，將進(jìn)一步闡明V-KIND-MAP2相互作用調(diào)節(jié)樹(shù)突樹(shù)枝狀模式的分子機(jī)制，這對(duì)于塑造神經(jīng)元通路至關(guān)重要，同時(shí)也可能是為理解某些MAP2相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病和精神疾病提供線索〔2，17〕。

3 KNDC1對(duì)HUVEC衰老作用的影響

KNDC1作為一種新型RasGEF蛋白，已被認(rèn)為 是一個(gè)與細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)，KNDC1過(guò)表達(dá)會(huì)加速HUVEC衰老〔7〕，而敲低則會(huì)延緩其衰老〔18〕。

3.1KNDC1過(guò)表達(dá)促進(jìn)HUVEC衰老的作用機(jī)制 李開(kāi)濟(jì)等〔2〕通過(guò)構(gòu)建人KNDC1腺病毒表達(dá)載體，觀察其在HUVEC中的表達(dá)及功能，證明了KNDC1過(guò)表達(dá)能夠誘導(dǎo)HUVEC衰老，且表現(xiàn)出明顯量效關(guān)系。姬勁銳等〔7〕在載體構(gòu)建成功的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)KNDC1促細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行了研究，研究表明，KNDC1過(guò)表達(dá)通過(guò)啟動(dòng)p53信號(hào)通路增加活性氧簇(ROS)表達(dá)。p53-ROS 正反饋環(huán)在調(diào)控KNDC1介導(dǎo)的細(xì)胞衰老中發(fā)揮重要作用，通過(guò)增加磷酸化p53蛋白的表達(dá)，KNDC1促進(jìn)p53表達(dá)并放大p53-ROS反饋環(huán)的作用，進(jìn)而加速細(xì)胞衰老的進(jìn)程。因此，KNDC1在介導(dǎo)細(xì)胞衰老過(guò)程中的完整信號(hào)通路應(yīng)該繼續(xù)研究，這將為衰老相關(guān)疾病提供新的治療方向。

3.2敲低KNDC1能預(yù)防HUVEC衰老的作用機(jī)制 Zhang等〔18〕研究表明，敲低KNDC1促進(jìn)HUVEC的增殖并延緩衰老。 其作用機(jī)制為：KNDC1的敲低通過(guò)抑制p53-p21-p16信號(hào)傳導(dǎo)途徑增加了S和G2/ M期細(xì)胞的百分比。 此外，KNDC1的敲低增加了內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達(dá)并改善了毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)的形成。 因此，敲低KNDC1有助于延遲內(nèi)皮細(xì)胞衰老，表明KNDC1有可能成為藥物開(kāi)發(fā)中的新靶點(diǎn)，延緩衰老過(guò)程，延長(zhǎng)人類壽命。

4 KNDC1對(duì)禽蛋殼超微結(jié)構(gòu)的影響

Duan等〔19〕發(fā)現(xiàn)KNDC1與乳頭密度(MD)顯著相關(guān)，認(rèn)為KNDC1可能參與纖維核心蛋白質(zhì)修飾，這決定了纖維核心是否是成核位點(diǎn)。 KNDC1對(duì)MD的確切功能作用仍有待闡明。對(duì)此提出了兩種方法來(lái)說(shuō)明KNDC1的功能：直接方式，KNDC1直接與纖維核心蛋白相互作用；間接方式，KNDC1通過(guò)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)修飾纖維核心蛋白。MD可以通過(guò)KNDC1介導(dǎo)的在成核位點(diǎn)直接或間接修飾纖維核心蛋白來(lái)調(diào)節(jié)。研究KNDC1對(duì)蛋殼超微結(jié)構(gòu)的遺傳影響，有助于提高蛋殼質(zhì)量，有助于對(duì)雞蛋殼及其他生物礦化材料的超微結(jié)構(gòu)和生物礦化的理解。

綜上所述，KNDC1功能與神經(jīng)元樹(shù)突生長(zhǎng)、HUVEC衰老、禽蛋殼超微結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，深入研究其功能和作用機(jī)制有可能為治療神經(jīng)退行性疾病、抗衰老藥物研發(fā)、生物礦化材料提供更多信息。