雷有娟,孫萬成,羅毅皓，馬海青，康海燕

(1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016； 2.青海省祁連縣畜牧獸醫(yī)站，青海 祁連 810499；3.青海省祁連縣默勤鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，青海 祁連 810499)

牦牛酥油主要成分為脂肪、水分和少量蛋白質(zhì)，并且含有豐富的微量元素[1]和不飽和脂肪酸。牦牛乳的功能性脂肪酸總量比普通牛乳約高3%[2]，夏季或者秋季從牦牛乳中提煉出的酥油呈鮮黃色，而冬季牦牛酥油則呈奶白色。研究表明[3-4]牦牛酥油功能性脂肪酸含量比原乳豐富，如亞油酸、花生四烯酸、α-亞麻酸、EPA和DHA。

磷脂(PL)是生物膜的基本組成成分，包括鞘磷脂和甘油磷脂兩大類，鞘磷脂主要存在于高等動物組織中，甘油磷脂在動物肝臟、腦及卵巢中含量豐富。目前，PL的分析方法有質(zhì)譜技術(shù)[5-6]，核磁共振光譜法[7-8]，高效液相色譜(HPLC)串聯(lián)不同的檢測器[9-10]，如紫外(UV)檢測器、示差折光(RI)檢測器、質(zhì)譜(MS)、蒸發(fā)光散射(ELSD)檢測器等。脂質(zhì)組學(xué)從2003年提出以來迅速成為研究熱點[11-12]，是代謝組學(xué)的一個重要研究領(lǐng)域，其研究的技術(shù)主要包括脂質(zhì)的提取、分離、分析鑒定以及相應(yīng)的生物信息學(xué)技術(shù)。本實驗主要圍繞牦牛酥油磷脂的提取，脂肪酸組成分析和脂質(zhì)組學(xué)分析展開研究，以期為牦牛酥油的進一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

白、黃牦牛酥油購自青海省祁連縣野牛溝牧民家；15%三氟化硼甲醇溶液；LC-MS級甲醇、LC-MS級甲基叔丁基醚，CNW Technologies；LC-MS級醋酸銨、LC-MS級氨水、LC-MS級二氯甲烷、LC-MS級異丙醇，默克公司；99%d7-PE、99%d7-LPC、99%d7-TG，Avanti；正己烷、無水乙醇、異丙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、氫氧化鉀、氯化鈉均為分析純。

Trace DSQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技公司；1290 UPLC超高效液相色譜儀，Agilent公司；Triple TOF 6600高分辨質(zhì)譜，AB Sciex；Heraeus Fresco17離心機，Thermo Fisher Scientific；BSA124S-CW天平，Sartorius；明澈 D24 UV純水儀，Merck Millipore；PS-60AL超聲儀；Phenomen Kinetex 1.7u C18 100 A 色譜柱(100 m×2.1 mm)，菲羅門；LC-04C醫(yī)用離心機；MVS-1旋渦混合器；THZ-82恒溫振蕩器；JM-B 3003電子天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 牦牛酥油磷脂提取

氯仿-甲醇(2∶1)提取牦牛酥油磷脂采用Folch法[13]。正己烷、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯提取牦牛酥油磷脂工藝為：分別稱取5份6 g牦牛酥油于50 mL離心管中，分別加入6倍體積的不同溶劑，45℃下恒溫振蕩1 h，之后在3 000 r/min下離心10 min,去除下層蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)，取上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮油脂，記錄油脂質(zhì)量，之后向提取的油脂中加入丙酮，溶液開始變渾濁時停止加入(丙酮添加量為上清液體積的2～3倍)，振蕩均勻后在4℃冰箱中靜置約25 h，離心分離出離心管底部粗磷脂后用氮氣吹干，得到磷脂產(chǎn)品，于-20℃冷凍保存。按下式計算提取的牦牛酥油中油脂得率和磷脂得率。

1.2.2 脂肪酸組成分析

1.2.2.1 樣品甲酯化

取0.5 g樣品于具塞試管中，加入10 mL甲醇和1 g氫氧化鉀，蓋住瓶口，于65℃恒溫振蕩2 h。取出冷卻后，加入濃鹽酸酸化至pH 2～3，再加入10 mL 正己烷，振蕩均勻，靜置10 min待其分層，取正己烷層(上層)于另一干燥試管中，氮氣吹干正己烷獲得游離脂肪酸。加入質(zhì)量分數(shù)為15%的BF3-CH3OH 1 mL，90℃水浴2 h；取出冷卻后，移入離心管中，加2 mL正己烷，振搖，3 500 r/min離心 2 min，取正己烷層氮氣吹干，待GC-MS分析。

1.2.2.2 GC-MS條件

DB-5MS色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)。程序升溫條件：初始溫度60℃，保持1 min；以 10℃/min升溫至180℃，以4℃/min升溫至280℃，保持10 min；以20℃/min升溫至300℃，保持2 min。載氣為高純He(99.999%)，進樣口溫度280℃，進樣量1.0 mL/min，傳輸線溫度285℃；離子源溫度250℃；溶劑延遲時間7 min；質(zhì)量掃描范圍(m/z)40～550。

1.2.3 牦牛酥油以及磷脂UHPLC-QTOF-MS脂質(zhì)組學(xué)分析

1.2.3.1 樣品處理

取10 mg樣品，加入400 μL H2O、960 μL甲基叔丁基醚-甲醇(MTBE-MeOH，體積比5∶1，含9 μL 10 mg/kgd7-PE(15∶0/18∶1)、9 μL 10 mg/kgd7-LPC(18∶1)、9 μL 100 mg/kgd7-TG(15∶0/18∶1/15∶0)。渦旋60 s，超聲10 min后在4℃、3 000 r/min條件下離心15 min，取上清液500 μL；重新加入500 μL MTBE-MeOH，渦旋60 s，超聲10 min后繼續(xù)在4℃、3 000 r/min條件下離心15 min，取上清液500 μL；再次加入500 μL MTBE-MeOH，渦旋60 s，超聲10 min，4℃、3 000 r/min條件下離心15 min，取上清液500 μL。合并3次上清液后旋干，用200 μL二氯甲烷-甲醇(DCM-MeOH，體積比1∶1)復(fù)溶，將上清液稀釋20倍。取75 μL上清液于2 mL進樣瓶，待UPLC-MS檢測。

1.2.3.2 UPLC-MS分析條件

流動相A為10 mmol/L HCOONH4(甲酸銨)-40% H2O-60% ACN(乙腈)，流動相B為10 mmol/L HCOONH4-10% ACN-90% IPA(異丙醇)，梯度洗脫程序見表1，進樣量 2 μL。轟擊能量35 eV，每50 ms 15張二級譜圖。ESI離子源參數(shù)：霧化氣壓(GS1)60 Pa，輔助氣壓60 Pa，氣簾氣壓30 Pa，溫度550℃，噴霧電壓-4 500 V。AB 6600 Triple TOF質(zhì)譜儀能夠在控制軟件(Analyst TF 1.7，AB Sciex)控制下基于IDA功能進行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。在每個數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，篩選出強度大于100的分子離子進行采集對應(yīng)的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

表1 UPLC流動相梯度洗脫程序

1.2.3.3 數(shù)據(jù)處理

使用ProteoWizard軟件將質(zhì)譜轉(zhuǎn)成mzXML格式，再使用XCMS軟件進行保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作，minfrac設(shè)為0.5，cutoff設(shè)為0.6。使用XCMS軟件、R程序包及脂質(zhì)二級數(shù)據(jù)庫進行脂質(zhì)鑒定，再根據(jù)加入的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度及其峰面積、各脂質(zhì)物質(zhì)峰面積以及RF數(shù)據(jù)代入相應(yīng)的公式計算樣品中脂質(zhì)物質(zhì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛酥油的油脂得率及磷脂得率

不同溶劑提取的牦牛酥油中油脂得率如圖1所示。

注：不同字母表示均值間有顯著性差異(p<0.05)。下同。
圖1 不同溶劑提取牦牛酥油中油脂得率的比較

從圖1可以看出：正己烷、異丙醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿-甲醇5種溶劑提取牦牛酥油中的油脂得率不同，黃酥油中油脂的含量高于白酥油，黃酥油油脂得率依次為正己烷>氯仿-甲醇>乙酸乙酯>異丙醇>乙醇，其中正己烷提取的油脂得率最高，達88.86%，乙醇提取的最低，白酥油油脂得率依次為正己烷>乙酸乙酯>氯仿-甲醇>異丙醇>乙醇，其中正己烷提取的油脂得率最高，達84.32%，乙醇提取的最低。

不同溶劑提取牦牛酥油的磷脂得率如圖2所示。

圖2 不同溶劑提取牦牛酥油中磷脂得率的比較

從圖2可以看出：正己烷、異丙醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿-甲醇5種不同溶劑提取牦牛酥油中磷脂得率也不同，黃酥油中磷脂含量略高于白酥油，黃酥油磷脂得率依次為正己烷>異丙醇>乙酸乙酯>氯仿-甲醇>乙醇，其中正己烷提取的磷脂得率最高，達12.27%，乙醇提取的最低，白酥油磷脂得率依次為正己烷>乙酸乙酯>氯仿-甲醇>異丙醇>乙醇，其中正己烷提取的磷脂得率最高，達11.28%，乙醇提取的最低。

2.2 牦牛酥油以及磷脂的脂肪酸組成(見表2)

表2 牦牛酥油及不同溶劑提取牦牛酥油磷脂脂肪酸組成及相對含量 %

脂肪酸白酥油不同溶劑提取白酥油磷脂脂肪酸相對含量乙酸乙酯乙醇異丙醇正己烷氯仿-甲醇黃酥油不同溶劑提取黃酥油磷脂脂肪酸相對含量乙酸乙酯乙醇異丙醇正己烷氯仿-甲醇C22∶000.8101.3900.9601.3501.8601.8100.5000.9301.7200.7001.6901.91C22∶600.16NDNDNDNDND00.07NDNDNDNDNDC23∶000.3900.6500.4501.2801.2300.82ND00.4401.2200.4400.8600.92C24∶000.2900.3500.3100.5900.7700.4900.2100.3900.5700.3200.9100.86C24∶100.05NDNDNDNDND00.04NDNDNDNDNDC25∶000.0500.06NDNDND00.10ND00.04NDNDND00.14C26∶000.07NDNDNDNDND00.10NDNDNDNDNDBCFA09.0607.6907.3404.5109.8507.1905.2804.5904.5003.7909.3105.34MUFA24.0507.5408.1808.9010.0904.8724.2909.1312.2404.1719.5208.51PUFA01.0400.1600.1000.3100.6900.0302.4600.4900.9800.0603.0200.39SFA74.9292.1991.7290.7988.6495.0973.2590.3786.7895.7774.1891.10MCFA03.9600.9101.2100.5701.1701.1505.8801.4000.8600.7603.3601.57LCFA96.0498.9498.7599.3798.2698.8194.1298.5799.1499.2493.1998.41

注：BCFA為支鏈脂肪酸，MUFA為單不飽和脂肪酸，PUFA為多不飽和脂肪酸，SFA為飽和脂肪酸，MCFA為中鏈脂肪酸，LCFA為長鏈脂肪酸(C13以上)，ND表示未檢出，iso-表示支鏈，anteiso表示反式支鏈，trans表示反式。

從表2可以看出：白酥油中共檢出33種脂肪酸，其中飽和脂肪酸22種，不飽和脂肪酸11種，支鏈脂肪酸6種；黃酥油共檢出32種脂肪酸，其中飽和脂肪酸20種，不飽和脂肪酸12種，支鏈脂肪酸6種。白酥油和黃酥油中飽和脂肪酸含量分別占脂肪酸總量的74.92%和73.25%，不飽和脂肪酸分別占脂肪酸總量的25.09%和26.75%，支鏈脂肪酸分別占脂肪酸總量的9.06%和5.28%，長鏈脂肪酸相對含量分別達96.04%和94.12%。

牦牛酥油磷脂中飽和脂肪酸含量最多，其次是單不飽和脂肪脂肪酸，多不飽和脂肪酸含量最少。在同一牦牛酥油樣品中，不同溶劑提取的磷脂中脂肪酸含量有顯著性差異(P<0.05)，白酥油中MUFA含量從多到少依次為正己烷>異丙醇>乙醇>乙酸乙酯>氯仿-甲醇，黃酥油中MUFA含量從多到少依次為正己烷>乙醇>乙酸乙酯>氯仿-甲醇>異丙醇；白酥油中PUFA含量從多到少依次為正己烷>異丙醇>乙酸乙酯>乙醇>氯仿-甲醇，黃酥油中PUFA含量從多到少依次為正己烷>乙醇>乙酸乙酯>氯仿-甲醇>異丙醇；白酥油中SFA含量從多到少依次為氯仿-甲醇>乙酸乙酯>乙醇>異丙醇>正己烷，黃酥油中SFA含量從多到少依次為異丙醇>氯仿-甲醇>乙酸乙酯>乙醇>正己烷；白酥油中BCFA含量從多到少依次為正己烷>乙酸乙酯>乙醇>氯仿-甲醇>異丙醇；黃酥油中 BCFA含量從多到少依次為正己烷>氯仿-甲醇>乙酸乙酯>乙醇>異丙醇。5種不同溶劑相比較而言，白酥油和黃酥油中以正己烷為提取劑提取的磷脂中MUFA、PUFA和BCFA含量相對較高，而SFA含量相對較低。

2.3 牦牛酥油UPLC-QTOF-MS脂質(zhì)組學(xué)全定量分析

用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜法(UPLC-QTOF-MS)對白色和黃色牦牛酥油以及提取的磷脂進行脂質(zhì)組學(xué)分析，用正、負離子模式分別檢測了4個樣本，發(fā)現(xiàn)負離子模式更適合檢測磷脂，因此選用負離子模式。負離子模式下牦牛酥油及磷脂脂質(zhì)組學(xué)測定結(jié)果見表3。

表3 負離子模式下牦牛酥油及磷脂脂質(zhì)組學(xué)測定結(jié)果

續(xù)表3

磷脂種類質(zhì)荷比白酥油/(ng/mL)黃酥油/(ng/mL)白酥油磷脂/(ng/mL)黃酥油磷脂/(ng/mL)PI(18∶1/16∶0)835.53387.381 153.418 509.973 221.16PI(16∶0/18∶1)835.533 443.263 015.4317 593.876 463.13PI(18∶1/18∶2)859.531 322.452 051.6310 410.152 034.56PI(18∶1/18∶1)861.555 549.776 379.9250 749.2719 368.52PI(18∶0/18∶1)863.567 632.006 170.3978 418.1727 397.54PI(18∶1/20∶4)883.531 006.961 608.086 855.835 191.59PI(18∶0/20∶4)885.553 747.563 932.0620 686.698 619.95

注：PC為磷脂酰膽堿， PE為磷脂酰乙醇胺，PG為磷脂酰甘油，PS為磷脂酰絲氨酸，Hex2Cer為二己糖基神經(jīng)酰胺，PI為磷脂酰肌醇；括號內(nèi)分別為磷脂結(jié)構(gòu)一位(R1)和二位(R2)所帶脂肪酸。

從表3可以看出，在負離子模式下，白酥油、黃酥油、白酥油磷脂和黃酥油磷脂中共檢測出5種甘油磷脂(PE、PC、PG、PS、PI)和1種神經(jīng)酰胺(Hex2Cer)。共鑒定出68種PL，其中PE 30種、PC 17種、PG 3種、PI 7種、PS 5種、Hex2Cer 6種。PE主要集中在m/z662～786區(qū)域,PC主要集中在m/z722～854區(qū)域,PI主要集中在m/z835～885區(qū)域，PS主要集中在m/z784～836區(qū)域。在牦牛白酥油中含量最高的是PS(18∶0/18∶1)、PE(18∶1/18∶1)、PS(18∶0/22∶5)、PS(18∶0/18∶2)和PC(16∶0/18∶1)，在牦牛黃酥油中含量最多的是PS(18∶0/18∶1)、PE(18∶1/18∶1)、PS(18∶0/18∶2)、PE(18∶0/18∶1)和PC(16∶0/18∶1)，在白酥油磷脂中含量最多的是PE(18∶1/18∶1)、PS(18∶0/22∶5)、PS(18∶0/18∶1)、PI(18∶0/18∶1)和PS(18∶0/18∶2)，黃酥油磷脂中含量最多的是PS(18∶0/18∶1)、PS(18∶0/18∶2)、PE(18∶1/18∶1)、PE(18∶0/18∶1)和PS(18∶0/22∶5)。它們的2條脂肪酸鏈 sn-1/sn-2位多數(shù)由18∶0和18∶1組成，所有的脂肪?；溣?4～26個碳，每個鏈上有0～5個雙鍵。

將表3數(shù)據(jù)整理分析得到牦牛酥油及其磷脂中6種磷脂的含量分布如圖3所示。

圖3 負離子模式下4個樣本中不同磷脂含量

從圖3可以看出，白酥油、黃酥油和白酥油磷脂中PE含量最多，分別占33.35%、35.49%和34.53%，其次為PS，分別占30.66%、33.53%和24.04%，PC分別占21.77%、20.53%和19.81%，PI分別占6.72%、4.51%和15.95%，PG含量最少，分別占1.05%、1.32%和0.67%。而黃酥油磷脂中PS含量最多，占42.71%，其次為PE，占30.26%，PC占12.86%，PI占8.90%，PG含量最少，占2.33%。Hex2Cer在白酥油、黃酥油、白酥油磷脂和黃酥油磷脂中分別占6.45%、4.62%、4.99%和2.94%。

3 結(jié) 論

利用不同提取溶劑(乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、氯仿-甲醇、正己烷)提取了白色和黃色牦牛酥油中油脂和磷脂，發(fā)現(xiàn)以正己烷為提取劑時油脂和磷脂得率均較高。經(jīng)GC-MS分析，在白酥油中檢出33種脂肪酸，其中飽和脂肪酸22種，不飽和脂肪酸11種，支鏈脂肪酸6種；在黃酥油中檢出32種脂肪酸，其中飽和脂肪酸20種，不飽和脂肪酸12種，支鏈脂肪酸6種。牦牛酥油磷脂中飽和脂肪酸含量最多，其次是單不飽和脂肪脂肪酸，多不飽和脂肪酸含量最少。但5種溶劑相比較而言，在白酥油和黃酥油中以正己烷為提取劑提取的磷脂中多不飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸含量相對較高。通過脂質(zhì)組學(xué)分析，白酥油、黃酥油、白酥油磷脂和黃酥油磷脂在負離子模式下共檢測出30種PE、17種PC、3種PG、6種Hex2Cer、5種PS和7種PI。 白酥油、黃酥油和白酥油磷脂中PE含量最多，其次為PS、PC和PI，PG含量最少，而黃磷酥油脂中PS含量最多，其次為PE、PC和PI，PG含量最少。