廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所 （廣東 廣州 510080）

內(nèi)容提要： 目的：通過體外染色體畸變試驗(yàn)來檢測納米銀敷料引起遺傳毒性的可能性，為臨床前安全性評價(jià)提供資料與提示。方法：根據(jù)《GB/T16886.3-2008/ISO 1099-3:2014》中推薦的方法選用中國倉鼠肺細(xì)胞（CHL）進(jìn)行體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)（CAT），在代謝活化系統(tǒng)（+S9）與非代謝活化系統(tǒng)（-S9）條件下，檢測納米銀敷料浸提液在+S9/6h、-S9/6h、-S9/24h三種處理?xiàng)l件下誘發(fā)CHL細(xì)胞的染色體畸變率。結(jié)果：納米銀敷料各處理組的染色體畸變率與陰性對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。在與CHL接觸24h后，細(xì)胞出現(xiàn)了明顯形態(tài)改變。結(jié)論：在該試驗(yàn)條件下，納米銀敷料浸提液對CHL細(xì)胞的染色體無明顯損傷作用，在24h接觸組中出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞毒性。

納米材料因其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，以及能夠與生物體發(fā)生高度活性的相互作用，廣泛應(yīng)用于多種領(lǐng)域，具有廣闊前景。納米銀抗菌醫(yī)用敷料是一種采用納米技術(shù)，以納米級別的超細(xì)銀顆粒載于醫(yī)用無菌紗布、非織造布、醫(yī)用脫脂紗布或功能相當(dāng)?shù)钠渌t(yī)用纖維制品組成的醫(yī)療器械。一般分為自粘型和非自粘型兩種類型。其中，無紡布、紗布或功能相當(dāng)?shù)钠渌t(yī)用纖維制品抗菌敷料分為自粘型和非自粘型兩種類型，脫脂針織紗布抗菌敷料為非自粘型，可用于燒燙傷、手術(shù)切口和皮膚感染傷口的輔助治療。納米銀是一種安全環(huán)保的天然殺菌劑，這種含納米銀的敷料能抑制與之相接觸的病原體，防護(hù)或輔助治療創(chuàng)面感染，從而加速創(chuàng)面愈合。此外由于納米銀敷料能持續(xù)釋放納米銀，可以減少換藥次數(shù)，減輕換藥痛苦，節(jié)約治療成本。納米銀抗菌醫(yī)用敷料對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、白色念珠菌的生長有明顯抑制作用[1]。與此同時(shí)，其可能存在的安全風(fēng)險(xiǎn)問題也備受關(guān)注。

遺傳毒性試驗(yàn)是非臨床安全性評價(jià)的一個重要內(nèi)容，通過一系列試驗(yàn)評價(jià)材料是否有遺傳毒性，對材料的致癌性有一定的預(yù)測作用，從而降低人群危害風(fēng)險(xiǎn)。而對納米材料的遺傳毒性進(jìn)行評價(jià)具有一定的特殊性，納米材料因?yàn)槠涑叽缧?yīng)等特點(diǎn)而易于出入細(xì)胞，并可在細(xì)胞內(nèi)蓄積，與細(xì)胞遺傳物質(zhì)產(chǎn)生直接或者間接的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，納米銀不僅可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還會引起DNA損傷的增加，不同粒徑的納米銀顆粒影響具有差異[2]。納米材料也易于在肝臟和免疫器官等部位分布蓄積，對于是否會因長期滯留于臟器內(nèi)而誘發(fā)腫瘤也是遺傳毒性研究中需要考慮的一個因素。由于沒有單獨(dú)一個遺傳毒性試驗(yàn)方法可檢測所有的遺傳毒性終點(diǎn)，遺傳毒性的評價(jià)大多采用組合試驗(yàn)的方法，國內(nèi)醫(yī)療器械遺傳毒性評價(jià)試驗(yàn)室一般的試驗(yàn)組合為Ames試驗(yàn)，小鼠淋巴瘤細(xì)胞基因突變試驗(yàn)（MLAT）和體外染色體畸變試驗(yàn)（CAT）[3,4]。體外染色體畸變試驗(yàn)可以直接對細(xì)胞內(nèi)的染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目進(jìn)行細(xì)微觀察，可以快速直觀判斷染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)變化異常，是最基本、重要的遺傳毒性評價(jià)方法之一，具有重要價(jià)值。本文主要介紹以體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)對納米銀敷料進(jìn)行評價(jià)。

1.材料與方法

1.1 一般材料

樣品與對照品：本次體外染色體畸變試驗(yàn)采用三種納米銀敷料產(chǎn)品，分別為樣品A、樣品B、樣品C。這三種產(chǎn)品基本涵蓋了目前臨床上使用的主要納米銀敷料類型，樣品A由無紡布和敷料海綿組成，樣品B由敷料海綿組成，樣品C由脫脂針織紗布組成。分別用相應(yīng)的浸提介質(zhì)吸足液體后，按照0.2g/mL的比例加入含血清培養(yǎng)基（購自Gibco），在37°C條件下浸提48h，所得浸提液為供試品液。陰性對照（浸提介質(zhì)）為含血清培養(yǎng)基。陽性對照的選擇為在非活化代謝條件下選用甲磺酸甲酯（MMS，購自Sigma）作為陽性對照，在活化代謝條件下選用環(huán)磷酰胺（CP，購自阿拉丁公司）[5]。

細(xì)胞株和主要儀器：細(xì)胞株為中國倉鼠肺細(xì)胞（Chinese Hamster Lung Cell，CHL），購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；倒置顯微鏡，購于Olympus公司；普通光學(xué)顯微鏡，購于徠卡公司；二氧化碳培養(yǎng)箱、冷凍離心機(jī)，均購于美國Thermo公司。

培養(yǎng)基與試劑：細(xì)胞培養(yǎng)液由RPMI 1640培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液（終濃度1%）、小牛血清（終濃度10%）配制而成，均購自Gibco。秋水仙素配制成5mg/mL，稀釋后使用（SIGMA，終濃度1μg/mL）。吉姆薩染液購自索萊寶，甲醇購自廣州化學(xué)試劑廠，冰乙酸購自廣州市東紅化工廠。

代謝活化系統(tǒng)：S9由苯巴比妥鈉與β-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)處理大鼠肝而獲得，購買于Moltox公司。本試驗(yàn)中所用S9混合液（S9mix）中的S9含量為10%，檢測時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配，S9與0.2mol/L的PBS、1.65mol/L的KCl、0.4mol/L的MgCl2、0.05mol/L的Glucose-6-Phosphate、0.025mol/L的NADP配制成S9 mix[6]。大鼠肝S9包括肝微粒體和胞質(zhì)酶，是體外遺傳毒性試驗(yàn)常用試劑，用以模仿受試物體內(nèi)代謝活化過程。然而S9本身有一定細(xì)胞毒性，因此在添加S9進(jìn)行活化的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，給藥處理時(shí)間通常不超過6h[7]。

1.2 方法

接觸處理：試驗(yàn)前接種一定數(shù)量細(xì)胞，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞長到近匯合狀態(tài)后棄培養(yǎng)液，加入對照品或供試品、S9混合液（不加S9混合液時(shí)，需用培養(yǎng)液補(bǔ)足），置于培養(yǎng)箱中?；罨x組接觸6h后吸去培養(yǎng)皿中的液體，用PBS清洗細(xì)胞3次，加入含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，于24h內(nèi)收獲細(xì)胞。非活化代謝組接觸時(shí)間為6h和24h。收獲前4h加入終濃度為1μg/mL秋水仙素。陰性對照組和陽性對照組同法制備。

收獲細(xì)胞與制片：消化細(xì)胞后加含血清培養(yǎng)液收集細(xì)胞。加入0.075mol/L氯化鉀溶液低滲處理后，加入固定液進(jìn)行固定，固定結(jié)束后離心棄上清，加入數(shù)滴新鮮固定液滴片，空氣干燥后用姬姆薩染液染色。

結(jié)果分析：在光學(xué)顯微鏡下每一試驗(yàn)組選擇200個分散良好的中期分裂相觀察染色體畸變的情況。在SPSS軟件上采用χ2檢驗(yàn)對各組染色體畸變率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 細(xì)胞毒性

根據(jù)相對細(xì)胞增長數(shù)RICC來評估供試品的細(xì)胞毒性，與6h接觸組比較，三種納米銀敷料浸提液接觸24h后的RICC明顯降低，RICC分別為20.4%、31.0%、28.1%（表1），結(jié)果表明CHL細(xì)胞與納米銀敷料浸提液接觸24h后均出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞毒性，鏡下觀察表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)的變化（圖1），細(xì)胞膨大、變長、胞內(nèi)小泡顆粒增多，部分細(xì)胞死亡脫落或者固縮變圓。而陰性對照組未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞生長抑制和形態(tài)上的改變，細(xì)胞呈梭形，不規(guī)則形狀，胞體貼壁鋪展均勻。

2.2 染色體畸變結(jié)果

納米銀敷料浸提液對CHL細(xì)胞染色體畸變作用的試驗(yàn)結(jié)果顯示，在加入S9混合液與不加S9混合液條件下所誘發(fā)的染色體畸變率均＜5%，其畸變率與陰性對照組相比差異均無顯著性。在同一條件下，陽性對照中非代謝活化組的甲磺酸甲酯誘發(fā)產(chǎn)生的畸變率為14.5%（6h）和18.5%（24h），代謝活化組的環(huán)磷酰胺誘發(fā)產(chǎn)生的畸變率為20.5%，與陰性對照組相比差異均具有顯著性（表1），這表明該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)成立可靠。另外，三種納米銀敷料各試驗(yàn)組均觀察到多倍體細(xì)胞（圖2）。

式中：RICC——細(xì)胞相對增長數(shù)；d1——試驗(yàn)樣品培養(yǎng)物中細(xì)胞的最終數(shù)量；d0——試驗(yàn)樣品培養(yǎng)物中細(xì)胞的起始數(shù)量；D1——對照品培養(yǎng)物中細(xì)胞的最終數(shù)量；D0——對照品培養(yǎng)物中細(xì)胞的起始數(shù)量。

3.討論

圖1. 各組接觸24h后鏡下觀察的CHL細(xì)胞形態(tài)（1a：對照組；1b：樣品組）

圖2. 油鏡下觀察的染色體形態(tài)（2a：多倍體；2b：正常染色體）

本實(shí)驗(yàn)通過浸提的方式得到供試品液，以其與CHL細(xì)胞直接接觸，在6h和24h分別收獲細(xì)胞，進(jìn)行染色體結(jié)構(gòu)畸變分析，結(jié)果顯示各試驗(yàn)組的CHL細(xì)胞染色體畸變率與陰性對照相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均無顯著性差異性，且染色體畸變率均＜5%。而陽性對照中非代謝活化組的甲磺酸甲酯和代謝活化組的環(huán)磷酰胺均顯示出明顯的陽性反應(yīng)。上述結(jié)果顯示，在本試驗(yàn)條件下，未檢測出納米銀敷料浸提液對CHL細(xì)胞染色體具有明顯的損傷作用。但是研究結(jié)果還顯示納米銀敷料在不同條件處理下均出現(xiàn)了多倍體細(xì)胞，多倍體是體外染色體畸變試驗(yàn)中的一種常見現(xiàn)象，但僅多倍體產(chǎn)生并不能提示受試物具有誘導(dǎo)非整倍體的潛力，而可能僅提示細(xì)胞周期紊亂[8]；多倍體也常常與細(xì)胞毒性的升高有關(guān)，這也與本實(shí)驗(yàn)計(jì)算出來的樣品相對細(xì)胞增長數(shù)RICC降低相符合。

近年來，含銀敷料逐漸廣泛應(yīng)用于臨床，銀離子本身帶有抑菌殺菌功能，而納米銀作為一種特殊的銀離子，具有比普通粒徑的銀離子更強(qiáng)效的抑菌作用，在醫(yī)療行業(yè)中被廣泛應(yīng)用于抗菌類醫(yī)藥和器械。目前對納米銀敷料的研究主要在于臨床上的使用功效以及安全性等方面，對于毒理學(xué)方面的研究報(bào)告甚少，尤其是遺傳毒性相關(guān)的方面。

表1.哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果

中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞（CHL）是體外染色體畸變試驗(yàn)常用的細(xì)胞株之一，由于CHL細(xì)胞株的不同世代之間，在細(xì)胞周期時(shí)間和克隆形成率等參數(shù)上沒有明顯差異，便于控制實(shí)驗(yàn)條件，且不受動物體內(nèi)營養(yǎng)及生理、免疫狀態(tài)影響，因而能定量研究，重復(fù)性也好，且能傳代保存，便于進(jìn)行形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)等觀察，并進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)、生物化學(xué)等分析，被廣泛用于染色體畸變試驗(yàn)的研究[9]。在于永生等[10]的研究中曾提出，肺臟是納米銀吸入染毒易損傷的靶器官，因此本研究采用CHL細(xì)胞為研究對象對納米銀敷料的遺傳毒性進(jìn)行評價(jià)，可以更好地探索納米銀敷料的細(xì)胞毒性，從而分析細(xì)胞增殖能力與遺傳物質(zhì)損傷之間的潛在聯(lián)系。為了排除因細(xì)胞毒性的影響而可能出現(xiàn)的假陰性和假陽性結(jié)果，需要在后續(xù)的試驗(yàn)中設(shè)置不同劑量組計(jì)算納米銀敷料對CHL細(xì)胞的IC50值，進(jìn)一步對納米銀敷料的遺傳毒性進(jìn)行深入研究評價(jià)。這也可以為納米銀產(chǎn)品的安全性評價(jià)以及相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)評估提供相應(yīng)依據(jù)。