任威威 薛兵 方惠敏 王迪 任艷青 楊彩瑞 薛思思 成秀梅

河北中醫(yī)學(xué)院，河北省肝腎病證研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（石家莊050091）

痤瘡是一種臨床較為常見(jiàn)的皮膚病，據(jù)文獻(xiàn)［1］報(bào)道，其影響全球9.4%的人口，已成為世界第8 大流行性疾病。痤瘡的產(chǎn)生與青春期皮膚的生理病理變化密切相關(guān)，包括皮脂腺增生、皮脂分泌增加、毛囊濾泡過(guò)度角化、痤瘡丙酸桿菌的定植等，其中雄激素水平升高引起的皮脂分泌異常是加速痤瘡產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究證實(shí)，人和許多動(dòng)物的皮脂腺受雄激素的調(diào)控，而雙氫睪酮（dihy?drotesto? sterone，DHT）是最有效的雄激素［2］，當(dāng)DHT 刺激皮脂腺中雄激素受體（androgen receptor，AR），AR 則向細(xì)胞核移位，以二聚體的形式與膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element binding protein 1，SREBP?1）反應(yīng)元件的特定DNA序列結(jié)合［3］，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游靶基因乙酰輔酶A 羥化酶1（acetyl coenzyme A carboxylase 1，ACC1），使脂質(zhì)分泌增多。SREBP 是參與體內(nèi)脂質(zhì)合成的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子［4-5］，在肝臟脂質(zhì)代謝方面研究較多［6］，但在皮脂代謝方面研究較少。本實(shí)驗(yàn)以耳廓和背部皮脂腺具有高度依賴(lài)雄激素特性的金黃地鼠為動(dòng)物模型［7］，通過(guò)觀察金黃地鼠耳廓皮脂腺狀態(tài)、檢測(cè)耳廓局部皮脂主要成分［8］游離脂肪酸（nonesterified free fatty acids，NEFA）和甘油三酯（TG）含量及耳廓組織中AR、SREBP?1、ACC1 蛋白表達(dá)水平，探索皮脂代謝異常與AR/SREBP?1/ACC1 信號(hào)通路的關(guān)系，為痤瘡的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF 級(jí)雄性金黃地鼠，體質(zhì)量（100±20）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（京）2016?0011。置于晝夜節(jié)律采光12 h，通風(fēng)良好，濕度控制在59% ～65%的人工環(huán)境中，飼以全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料，自由飲水，1 周后用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核，批準(zhǔn)號(hào)：HBTCM?2017?09。

1.2 主要試劑與儀器DHT粉劑（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：D0825A）；NEFA測(cè)試盒、TG測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20190826、20190822）；通用二步法試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SP?9000）；抗SREBP?1 多克隆抗體、AR 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)P36956、P10275）；ACC1 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)21923?1?AP）；GAPDH 抗體（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)GB11002）。

游標(biāo)卡尺（上海量具刀具廠）；微量進(jìn)樣器（上海高鴿工貿(mào)有限公司）；Nanodrop 2000c 超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo 公司）；DP72 光學(xué)電子顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；ImageQuant LAS?4000 化學(xué)發(fā)光成像分析儀（日本GE 公司）164?5052 蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移儀（美國(guó)Bio?rad 公司）。

1.3 分組與給藥雄性金黃地鼠耳廓和背部皮脂腺天生具有高度依賴(lài)雄激素特性，并且金黃地鼠皮脂腺的生理結(jié)構(gòu)，皮膚代謝周期以及皮脂腺形態(tài)與人體皮膚相似，因此可作為研究皮脂腺功能和藥物抗雄激素作用最佳動(dòng)物模型［7］。20 只LVG雄性金黃地鼠隨機(jī)分為兩組，即對(duì)照組、DHT 組。DHT 粉劑溶解于無(wú)水乙醇溶液中，稀釋濃度為0.1 mg/mL，用微量進(jìn)樣器取5 μL 的DHT 溶液外涂于金黃地鼠內(nèi)耳廓中2/3 處，對(duì)照組外涂同等劑量無(wú)水乙醇溶液，每日1 次，連續(xù)給藥18 d［9］。

1.4 耳廓組織HE 染色采用直徑為9 mm 打孔器取下金黃地鼠耳廓中2/3 處組織，經(jīng)生理鹽水沖洗，濾紙吸干，4%多聚甲醛室溫固定后進(jìn)行石蠟包埋、切片（厚約3 μm）、脫蠟、水化、常規(guī)蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察兩組耳廓組織的病理變化。

1.5 耳廓組織油紅O 染色將金黃地鼠耳廓組織加入適當(dāng)包埋劑進(jìn)行固定，用冰凍切片機(jī)切取8 μm 冰凍組織，進(jìn)行油紅O 染色，蘇木素復(fù)染，因油紅O 為脂溶性，可使組織細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)成分顯示為橘紅色，因此可通過(guò)顯微鏡觀察金黃地鼠耳廓組織脂質(zhì)分泌情況。

1.6 耳廓組織NEFA 和TG 含量檢測(cè)取下金黃地鼠耳廓組織，稱(chēng)重后加入9 倍體積生理鹽水，進(jìn)行組織勻漿，提取上清后按照比色法標(biāo)準(zhǔn)操作步驟，檢測(cè)耳廓組織中NEFA 和TG 的含量。

1.7 耳廓組織AR、SREBP?1、ACC1 蛋白含量檢測(cè)免疫組化：將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水化、抗原修復(fù)（檸檬酸鈉加熱修復(fù)）、抗體孵育、DAB 染色、蘇木精復(fù)染、PBS 返藍(lán)、樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察切片染色情況。以PBS 為陰性對(duì)照，結(jié)果可見(jiàn)細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽(yáng)性顯色區(qū)域?yàn)樽攸S色。使用圖像分析軟件Image J 1.8.0，整理分析陽(yáng)性顯色的平均光密度值（IOD/Area）。

Western Blot：提取金黃地鼠耳廓組織總蛋白，BCA 法測(cè)定各組蛋白濃度。根據(jù)蛋白定量結(jié)果進(jìn)行上樣（8 μL）、SDS?PAGE 電泳2 h。轉(zhuǎn)膜條件：SREBP?1 和AR 半干轉(zhuǎn)法（25 V，30 min）；ACC1 濕轉(zhuǎn)法（300 mA，4 h）。經(jīng)脫脂奶粉封閉1 h 后，加入一抗SREBP?1（1∶2 000）、AR（1∶1 000）、ACC1（1∶1 000）置4 ℃過(guò)夜，洗膜，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶3 000），采用化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耳廓組織病理變化對(duì)照組：金黃地鼠內(nèi)耳廓皮脂腺分布呈分葉狀，排列相對(duì)松散，部分腺葉較小。DHT 組：金黃地鼠內(nèi)耳廓皮脂腺排列較對(duì)照組更加緊密，腺葉增大且數(shù)目增多。見(jiàn)圖1。

圖1 耳廓組織病理圖片（HE，×100）Fig.1 Pathological picture of ear tissue（HE，×100）

2.2 耳廓組織油紅O 染色結(jié)果對(duì)照組金黃地鼠耳廓組織皮脂腺細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)少量團(tuán)狀紅色脂滴；DHT 組與對(duì)照組比較，皮脂腺細(xì)胞內(nèi)脂滴分泌增多，且融合成片狀。見(jiàn)圖2。

圖2 耳廓組織油紅O 染色病理圖片（油紅O，×400）Fig.2 Pathological picture of oil red O staining in ear tissue（oil red O，×400）

2.3 耳廓組織局部游離脂肪酸（NEFA）和甘油三酯（TG）含量變化DHT 組與對(duì)照組比較，金黃地鼠耳廓局部NEFA 和TG 含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表1。

表1 DHT 對(duì)皮脂中NEFA 和TG 含量的影響Tab.1 Effect of DHT on NEFA and TG content in sebum x±s

2.4 耳廓組織AR、SREBP?1、ACC1蛋白含量變化

2.4.1 免疫組化法檢測(cè)結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，AR 陽(yáng)性染色區(qū)域?yàn)槠ぶ偌?xì)胞核，與對(duì)照組比較，DHT 組AR 表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01）；SREBP?1 陽(yáng)性染色區(qū)域?yàn)槠ぶ偌?xì)胞核，與對(duì)照組比較，DHT 組SREBP?1 表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；ACC1 陽(yáng)性染色區(qū)域?yàn)槠ぶ偌?xì)胞核和細(xì)胞漿，與對(duì)照組比較，DHT 組ACC1 表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）；免疫組化圖片見(jiàn)圖3，各組平均光密度值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

圖3 DHT 對(duì)AR、SREBP?1、ACC1 蛋白表達(dá)水平的影響（IHC，×400）Fig.3 Effect of DHT on expression level of AR，SREBP?1 and ACC1（IHC，×400）

表2 兩組AR、SREBP?1、ACC1 平均光密度值Tab.2 Average optical density values of AR，SREBP?1 and ACC1 in two groups ±s

表2 兩組AR、SREBP?1、ACC1 平均光密度值Tab.2 Average optical density values of AR，SREBP?1 and ACC1 in two groups ±s

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別對(duì)照組DHT 組AR 0.262±0.006 0.383±0.027##SREBP-1 0.369±0.016 0.450±0.029#ACC1 0.272±0.009 0.342±0.030#

2.4.2 Western Blot 檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組相比較，DHT 組AR、SREBP?1、ACC1 蛋白表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖4。

3 討論

圖4 耳廓組織AR、SREBP?1、ACC1 蛋白表達(dá)水平比較Fig.4 Comparison of expression levels of AR，SREBP?1 and ACC1 proteins in ear tissue

痤瘡是一種皮脂腺慢性炎癥性疾病，于青春期多見(jiàn)，其臨床表現(xiàn)主要有脂溢、粉刺、丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)等［10］。痤瘡的產(chǎn)生與皮膚生理病理變化相關(guān)，包括皮脂腺增生、皮脂分泌增加、毛囊濾泡過(guò)度角化、痤瘡丙酸桿菌的定植等，其中雄激素水平升高引起的皮脂分泌異常是加速痤瘡產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此抑制皮脂分泌是治療痤瘡的重要靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以雄性金黃地鼠為動(dòng)物模型，其耳部和背部皮脂腺高度依賴(lài)雄激素水平，且生理和解剖結(jié)構(gòu)與人體皮膚相似，因此是研究皮脂腺功能和雄激素效應(yīng)的最佳動(dòng)物模型［7］。DHT 為最有效的雄激素［2］，實(shí)驗(yàn)通過(guò)外用DHT 對(duì)金黃地鼠耳部皮脂腺進(jìn)行干預(yù)，觀察高雄激素刺激下皮脂腺功能和皮脂分泌狀態(tài)，并進(jìn)一步研究皮脂代謝異常是否與雄激素誘導(dǎo)AR/SREBP?1/ACC1 信號(hào)通路的過(guò)度激活有關(guān)。

人體皮脂主要由NEFA/TG（57%）、蠟酯（26%）、角鯊烯（12%）和膽固醇（2%）組成［8］，適量的皮脂可以保護(hù)皮膚，防止感染，但皮脂分泌過(guò)多則是痤瘡形成的重要病理因素［11］。油紅O 為脂溶性染料，可使組織中脂滴著色，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)油紅O 染色和生化檢測(cè)皮脂主要成分NEFA 及TG 含量，探討皮脂分泌情況，結(jié)果證實(shí)，DHT 組金黃地鼠耳廓組織較對(duì)照組脂滴增多，且多融合成片，皮脂主要成分NEFA 和TG 含量均明顯升高，說(shuō)明DHT 可刺激金黃地鼠耳廓皮脂腺，使皮脂分泌增多。

皮脂的分泌與皮脂腺功能密切相關(guān)，而皮脂腺功能受雄激素的調(diào)控。睪酮是人體中主要的循環(huán)雄激素，相關(guān)研究［12］表明，其血清濃度水平與皮脂分泌量和痤瘡嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，而睪酮主要是在5?α還原酶的作用下轉(zhuǎn)化為更有效力的DHT，并通過(guò)與AR 結(jié)合，進(jìn)而刺激皮脂腺細(xì)胞增殖。皮脂腺中的基底細(xì)胞和分化的皮脂腺細(xì)胞均有AR的表達(dá)［13］，并且有核定位。AR 是一種存在于X 染色體上由雄激素配體激活的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子［14］，屬于類(lèi)固醇/核受體超家族［15］，當(dāng)DHT 與AR 結(jié)合后，AR 則與熱休克蛋白解離，發(fā)生構(gòu)象改變，進(jìn)而暴露核移位信號(hào)。在細(xì)胞核內(nèi)，被激活的AR與雄激素反應(yīng)元件（androgen response element，ARE）DNA序列結(jié)合，從而誘導(dǎo)相關(guān)脂質(zhì)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄［16］。SREBPs 是一種調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的重要核轉(zhuǎn)錄因子［17］，其裂解活化蛋白（SREBP cleavage?activating protein，SCAP）內(nèi)含子上存在ARE［18］，因此ARE 與AR 的結(jié)合，可以加速SCAP 的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)SREBPs的活化。SREBP?1 可與下游靶基ACC 啟動(dòng)子區(qū)的固醇調(diào)節(jié)原件（sterol?response element，SRE）DNA序列結(jié)合［19-20］，ACC 是控制脂肪酸生物合成的第一步限速酶［13］，主要存在兩種基因形式ACC1 和ACC2［21］，ACC1 多存在于脂肪組織中，ACC1 表達(dá)升高可間接降低脂肪酸的氧化水平，促進(jìn)皮脂主要成分NEFA 合成［22］。

雄激素與AR 結(jié)合后介導(dǎo)的SREBP 通路與眾多疾病有關(guān)，SHIN 等［23］研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制SREBP的裂解活化蛋白以及生長(zhǎng)因子β，可抑制DHT 誘導(dǎo)的雄激素性脫發(fā)。SREBP 通路在肝臟脂質(zhì)代謝方面同樣發(fā)揮著重要作用［24-25］，但該通路在雄激素誘導(dǎo)的皮脂代謝異常方面研究較少。為進(jìn)一步探討DHT 刺激皮脂腺后皮脂分泌增多是否與AR/SREBP?1/ACC1 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化和Western Blot 分別檢測(cè)金黃地鼠耳廓組織AR、SREBP?1、ACC1 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，DHT 可使AR、SREBP?1、ACC1 蛋白表達(dá)水平升高，說(shuō)明其通過(guò)AR/SREBP?1/ACC1信號(hào)通路的過(guò)度激活使金黃地鼠耳廓皮脂分泌增多。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與ROSIGNOLI 等［26］提出的雄激素可通過(guò)SREBP 信號(hào)通路影響皮脂腺細(xì)胞增值和脂質(zhì)分泌增多的觀點(diǎn)相吻合，充分證明AR/SREBP?1/ACC1在皮脂代謝方面的重要作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步探討了雄激素可通過(guò)AR/SREBP?1/ACC1 信號(hào)通路調(diào)節(jié)皮脂分泌的作用機(jī)制，為痤瘡的臨床治療提供新的思路。