周易，劉暢，易欣，蔣學(xué)俊

擴(kuò)張型心肌?。―CM）是指在心臟無(wú)異常壓力負(fù)荷或冠狀動(dòng)脈（冠脈）疾病等其他心臟疾病的情況下，出現(xiàn)的以左心室或雙心室擴(kuò)大并伴有心臟舒張、收縮功能障礙的一類(lèi)疾病，是臨床上出現(xiàn)進(jìn)展性心力衰竭和心源性猝死的主要原因[1，2]。心室重構(gòu)是DCM的主要病理改變，包括心肌細(xì)胞不規(guī)則肥大和心肌纖維化[3]。研究發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號(hào)通路參與調(diào)控真核細(xì)胞內(nèi)許多重要生理活動(dòng)，涉及細(xì)胞增殖、分化和凋亡等[4]。研究發(fā)現(xiàn)，MAPKs信號(hào)通路與壓力負(fù)荷過(guò)大或心肌缺血所致的心肌纖維化密切相關(guān)。因此，本研究擬通過(guò)檢測(cè)DCM臨床心肌組織樣本中MAPKs信號(hào)通路分子的總蛋白及磷酸化水平，以及其下游分子早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子（EGR-1）的表達(dá)水平，探討MAPKs信號(hào)通路激活在DCM患者心肌纖維化中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象收集DCM患者接受心臟移植者受體心臟6例（DCM組），并選擇移植失敗的供體心臟6例作為對(duì)照組。DCM的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2006年美國(guó)AHA制定的DCM診斷標(biāo)準(zhǔn)，即左心室舒張末期內(nèi)徑＞55 mm、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）＜45%或左心室縮短速率＜25%[5]。排除冠狀動(dòng)脈性心臟病、先天性心臟病、高血壓、自身免疫性疾病等可以引起心臟擴(kuò)張的心血管疾病和全身性疾病。同時(shí)，收集DCM患者一般臨床資料，包括年齡、性別、左心房?jī)?nèi)徑（LAD）、右心房?jī)?nèi)徑（RAD）、左心室內(nèi)徑（LVD）、右心室內(nèi)徑（RVD）、室間隔厚度（IVSD）、LVEF。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本收集收集DCM患者受體心臟及移植失敗的供體心臟的左心室肌組織。切取離體心臟的左心室肌組織，生理鹽水沖洗后，分為兩份。一份立即放入凍存管于液氮中迅速冷凍后-80℃冰箱中保存，用于Western Blot檢測(cè)；另一份置于4%多聚甲醛中固定，制作病理石蠟切片，后續(xù)染色觀察。

1.2.2 Western Blot法檢測(cè)心室肌組織中MAPKs信號(hào)通路分子的磷酸化水平Western blot法測(cè)定兩組心室肌組織中MAPKs信號(hào)通路分子MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38 的總水平和磷酸化水平、以及下游分子EGR-1的蛋白表達(dá)水平。心室肌組織研磨后加入新鮮配制的蛋白裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定各樣品的蛋白濃度，將各樣品蛋白濃度調(diào)整一致，與上樣緩沖液混合，加熱煮沸10 min，使蛋白充分變性，并分裝保存在-80℃。蛋白溶解后，行SDS-PAGE凝膠電泳，再4℃下轉(zhuǎn)膜，PVDF膜在5%脫脂奶粉中封閉2 h，分別加入抗MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38、p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-JNK1/2、p-P38、EGR-1、GAPDH一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，二抗孵育2 h，顯影。以GAPDH為內(nèi)參，測(cè)定目標(biāo)條帶及GAPDH的灰度值，兩者灰度值比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 蘇木精-伊紅染色（HE染色）4%多聚甲醛固定后的心室肌組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟制成石蠟切片。石蠟切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟、下行梯度酒精脫苯、水洗、蘇木素染色、0.1%鹽酸酒精分化、Scott液返藍(lán)、伊紅染色、上行梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)脂封片；最后，顯微鏡下觀察心肌組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)及排列特點(diǎn)。

1.2.4 苦味酸-天狼星紅染色（PSR染色）制備好的石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水后，依次經(jīng)磷鉬酸染色、0.1%苦味酸天狼星紅染色、0.01N鹽酸分化、上行梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)脂封片；最后，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織中紅色膠原纖維的分布情況，拍照并計(jì)算膠原容積百分比（CVF），CVF=膠原面積/圖像面積×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 19.0軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料DCM患者和對(duì)照組年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。DCM患者超聲心動(dòng)圖檢查提示心室擴(kuò)大，左心室擴(kuò)張更為顯著（69.83±14.71 mm），呈離心性擴(kuò)張；心肌室壁運(yùn)動(dòng)幅度普遍減低，左室射血分?jǐn)?shù)明顯下降（26.83±8.49%）。

2.2 DCM患者心肌組織學(xué)病理改變與對(duì)照組相比，HE染色見(jiàn)DCM組心肌組織內(nèi)心肌細(xì)胞不同程度肥大，胞漿內(nèi)少許空泡形成；心肌細(xì)胞排列紊亂，周?chē)g質(zhì)組織纖維化明顯（圖1A）。PSR染色可見(jiàn)DCM組心肌組織間質(zhì)內(nèi)大量增粗的、亮紅色膠原纖維沉積，呈彌漫性分布，CVF較對(duì)照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1B和1C）。以上提示，DCM患者心肌纖維化、心室重構(gòu)明顯。

2.3 DCM患者心肌組織MAPKs信號(hào)通路分子的總蛋白及磷酸化水平Western Blot結(jié)果顯示，兩組間MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38的總蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，DCM組心肌組織內(nèi)MEK1 /2、ERK1/2、JNK1/2、P38 的磷酸化水平均明顯增高（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

2.4 MAPKs信號(hào)通路下游分子EGR-1的蛋白表達(dá)水平Western Blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DCM組心肌組織內(nèi)MAPKs信號(hào)通路下游分子EGR-1的蛋白表達(dá)水平明顯增高（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

3 討論

目前，DCM臨床治療大多基于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、β受體阻滯劑等藥物，通過(guò)減慢心率、減緩心室重構(gòu)等改善DCM患者的預(yù)后，心臟移植是終末期DCM患者最佳的治療手段[6]。研究表明，心肌纖維化是DCM的主要特征，細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)大量膠原蛋白沉積；這些膠原蛋白主要由心臟成纖維細(xì)胞（CFs）合成，正常心肌中I型膠原蛋白（Col Ⅰ）與Ⅲ型膠原蛋白（Col Ⅲ）的比例相對(duì)恒定，心肌纖維化時(shí)心肌組織中ColⅠ與Col Ⅲ的比例升高[7，8]。因此，減輕甚至逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，是目前DCM治療研究的新方向[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，DCM患者心肌組織中ColⅠ、Col Ⅲ的表達(dá)增加，CVF明顯升高，與既往研究類(lèi)似。

圖1 對(duì)照組和DCM組心室肌組織的病理學(xué)改變[A和B為對(duì)照組和DCM組患者心室肌組織HE染色及PSR染色結(jié)果（HE染色×40，PSR染色×20；PSR染色中黃色為心肌組織，紅色為膠原纖維），C為對(duì)照組和DCM組患者心室肌組織的CVF。與對(duì)照組相比，P＜0.05]

圖2 對(duì)照組和DCM組患者心肌組織中MEK1 /2、ERK1 /2、JNK1/2、P38的總蛋白及磷酸化水平（與對(duì)照組相比，**P＜0.01，***P＜0.001）

圖3 對(duì)照組和DCM組患者心肌組織中EGR-1的蛋白表達(dá)水平（與對(duì)照組比較，**P＜0.01）

MAPKs信號(hào)通路是真核細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要成員，通過(guò)MAPKK激酶（MAPKKK/MEKK）、MAPK激酶（MAPKK/MEK）和MAPK的級(jí)聯(lián)模式傳導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)，依次磷酸化激活將上游信號(hào)傳遞至下游應(yīng)答分子，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡、炎癥和纖維化修復(fù)等生物學(xué)過(guò)程[10，11]。在哺乳動(dòng)物中，研究較為廣泛的MAPKs信號(hào)通路是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun N-末端激酶（JNK）/應(yīng)激活化蛋白激酶（SAPK）和P38 絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase）信號(hào)通路[12-14]。Chang等[15]利用促炎因子IL-17對(duì)兔缺血性心力衰竭模型進(jìn)行處理，心肌組織內(nèi)p-P38 、p-JNK、p-ERK1/2及其下游靶蛋白IL-6、TNF、CCL20、CXCL1的表達(dá)水平升高，促進(jìn)心肌細(xì)胞炎癥、凋亡、纖維化進(jìn)程，最終導(dǎo)致心室重構(gòu)。此外，RAS-RAF-MEK1/2-ERK1/2通路的激活可促進(jìn)CFs的增殖、促進(jìn)心肌組織間質(zhì)內(nèi)膠原沉積，加速心肌纖維化的進(jìn)展；而ERK1/2抑制劑可顯著抑制CFs增殖、膠原蛋白合成及纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，最終減輕心肌纖維化[16-18]。部分臨床前研究發(fā)現(xiàn)P38通路在缺血性心臟病、心肌梗死和動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，DCM患者心肌組織中MAPKs信號(hào)通路分子MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38的磷酸化水平也增高，尤以MEK1/2、ERK1/2的磷酸化水平升高最為顯著，以上結(jié)果表明MAPKs信號(hào)通路的磷酸化激活可能對(duì)DCM心肌纖維化、心室重構(gòu)發(fā)揮促進(jìn)作用。

早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子（EGR-1），最早被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和存活中發(fā)揮作用，后發(fā)現(xiàn)其在免疫應(yīng)答的啟動(dòng)過(guò)程中也發(fā)揮重要作用，是生長(zhǎng)因子介導(dǎo)纖維化的核心轉(zhuǎn)錄因子[20]。EGR-1可作為ERK1/2通路的下游調(diào)控分子，γ-谷維素可清除活性氧參與抑制ERK1/2通路，從而抑制EGR-1的表達(dá)[21]。EGR-1可與啟動(dòng)子結(jié)合上調(diào)骨橋蛋白（OPN），OPN又可通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路上調(diào)EGR-1的表達(dá)，在血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖中發(fā)揮重要作用；ERK1/2通路抑制劑PD98059、JNK通路抑制劑SP600125、P38通路抑制劑SB203580分別處理血管平滑肌細(xì)胞，均可顯著抑制OPN誘導(dǎo)的EGR-1表達(dá)，而ERK1/2抑制劑PD98059的抑制作用最顯著[22]。Yasuoka等[23]研究結(jié)果表明，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-5（IGFBP-5）通過(guò)激活MAPK信號(hào)、誘導(dǎo)核EGR-1與IGFBP-5相互作用，促進(jìn)纖維化基因轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)肺纖維化表型。本研究發(fā)現(xiàn)，DCM患者心肌組織中MAPKs下游效應(yīng)分子EGR-1的表達(dá)也明顯升高，進(jìn)一步表明MAPKs信號(hào)通路的磷酸化激活，促進(jìn)下游應(yīng)答分子EGR-1的表達(dá)，再對(duì)DCM心肌纖維化、心室重構(gòu)發(fā)揮促進(jìn)作用。

綜上所述，MAPKs信號(hào)通路在促進(jìn)DCM患者心肌纖維化中發(fā)揮重要作用，不是通過(guò)單一信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)，而是多條信號(hào)通路協(xié)同促進(jìn)DCM患者心肌纖維化的進(jìn)展。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用MAPKs信號(hào)通路各級(jí)激酶的抑制劑有助于抑制心肌纖維化，仍處于臨床前研究階段；目前，臨床上尚缺乏治療DCM的MAPKs信號(hào)通路抑制劑類(lèi)藥物。值得堅(jiān)信的是，DCM的臨床治療，尤其在減輕心肌纖維化、改善心室重構(gòu)方面，MAPKs通路仍是值得深入研究的重要靶點(diǎn)。