劉鵬燕 邢慧敏 徐勝賢 方超友 李秀真 李兆樓Δ

(1濟寧醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，濟寧 272013；2濟寧醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，濟寧 272067)

к-卡拉膠(к-carrageenan,к-CA)是從紅色海藻中提取的一種天然多糖[1]。由于提取工藝簡單、高效，к-CA這種海洋多糖作為原材料得以大規(guī)模應用。к-CA分子鏈是由β-(1,3)-D-半乳糖-4-硫酸基與α-(1,4)-(3,6-內(nèi)醚)-D-半乳糖組成的二糖交替共聚物[2]，這條鏈在降溫的水溶液里或加入某種鹽(如KCl)可以完成由雜亂線狀的線圈向有序螺旋的構(gòu)象變化[3]；通過氫鍵作用或者離子間作用更容易形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)凝膠化過程。然而，單純к-CA凝膠脆弱且有剛性，并且可能嚴重析出水分[4]。因而，к-CA復合凝膠在科研領(lǐng)域和制藥工業(yè)應用中越來越受關(guān)注[4-7]。由于復合凝膠內(nèi)部不同多糖分子鏈的極性基團影響而發(fā)生協(xié)同作用[8]，極大改善了CA凝膠的性能，如凝膠強度增大等[9]。天然多糖黃原膠(Xanthan gum,XG)，是醫(yī)藥工業(yè)應用價值較高的微生物多糖輔料[10]。它是由油菜黃單孢菌分泌的多糖，分子主鏈由β-(1,4)-D-葡萄糖構(gòu)成，主鏈每間隔兩個葡萄糖單元就出現(xiàn)一個短的側(cè)鏈，其側(cè)鏈由相連的三個單糖組成：甘露糖-葡萄糖-甘露糖，其中第一個甘露糖通常被乙?；揎椂B接著主鏈，末端的甘露糖常與丙酮酸發(fā)生縮醛反應而被結(jié)合，中間的葡萄糖一般為葡萄糖醛酸的形式[11]。XG分子主鏈可以被側(cè)鏈纏繞進而形成有序螺旋，其二級結(jié)構(gòu)可以由兩個單鏈或者一個雙螺旋構(gòu)成[12]，XG的分子結(jié)構(gòu)特點使它可以充當к-CA凝膠的穩(wěn)定劑。單獨XG水凝膠具有弱凝膠性質(zhì)，至今沒有用于載藥的報道[13]。而利用к-CA水凝膠進行制劑學研究的報道也不多見[14]。目前關(guān)于к-CA和XG的復合凝膠體系研究未見報道。本文研究合成了新型к-CA/XG復合凝膠，觀測了其結(jié)構(gòu)形貌、流變學特性和形成機制等，并應用其制備了左氧氟沙星(levofloxacin,LVFX)新型抗菌制劑。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

Olympus BX51光學顯微鏡；German Zeiss FESEM掃描電子顯微鏡；German Bruker/D8ADVANCE X射線衍射儀；Thermo Haake RS300流變儀；島津IRAffinity-1S傅里葉變換紅外光譜儀；PerkinElmer AAnalyst 800原子吸收光譜儀。

1.2 復合凝膠的制備

稱取0.1754g к-CA和0.0753g XG放入比色管中，然后加蒸餾水6ml，超聲20min，于65℃下恒溫攪拌8h，冷卻到室溫直至凝膠形成，倒置比色管后凝膠不能流動即可。將所得凝膠，置于真空干燥箱內(nèi)40℃干燥24h，得到干凝膠樣品。

1.3 光學顯微鏡(OM)和電子顯微鏡(SEM)觀察

用OM觀察凝膠樣品結(jié)構(gòu)形貌，并對典型形貌拍照記錄。將干燥所得的干凝膠樣品進行噴金，并用SEM觀察干凝膠結(jié)構(gòu)形貌，得到SEM圖片。

1.4 流變學分析

采用Thermo Haake RS300流變儀堆板系統(tǒng)(直徑35mm，間隙0.105mm)，25℃進行動態(tài)應變掃描，在線性粘彈范圍內(nèi)對各凝膠樣品掃頻分析。隨機抽取水凝膠樣品，平行測定三次求平均值。

1.5 紅外光譜(FTIR)分析

采用島津IRAffinity-1S傅里葉變換紅外光譜儀，KBr壓片法，得干凝膠樣品的紅外光譜圖。

1.6 X光粉末衍射法(XRD)

將干凝膠樣品置于樣品池，采用German Bruker/D8ADVANCE X射線衍射儀掃描，并記錄譜圖。

1.7 載藥凝膠的制備

首先，使用滅菌蒸餾水配制一定濃度的LVFX溶液，然后分別稀釋成16μg/ml(用于金黃色葡萄球菌)和4μg/ml(用于大腸埃希氏菌)兩種LVFX稀溶液。稱取0.1754g к-CA和0.0753g XG放入比色管中，然后在攪拌下加入6ml LVFX溶液，超聲20min，65℃恒溫攪拌8h，冷卻到室溫直至凝膠形成，倒置比色管后凝膠不能流動即可。所得兩種載藥量不同的凝膠(備用)，可分別用于金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌的抑菌測試。

1.8 載藥凝膠的抑菌測試

采用自制的牛津杯法測試LVFX載藥凝膠的抑菌效果，模型菌株是金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌，采用無菌條件下涂布劃線法接種。分別將200μl藥物凝膠和200μl空白對照凝膠注入含有105CFU/ml測試菌液的培養(yǎng)皿，37℃培育24h。通過測量凝膠斑點區(qū)的抑菌圈直徑大小來確定藥物凝膠的抑菌效果，使用與藥物凝膠中同濃度的LVFX溶液做陽性抗菌對照物。所有試驗結(jié)果都是三次平行測定的平均值，利用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，方差分析采用Duncan法，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶膠與凝膠相變過程

在65℃加熱和攪拌8h下，熱к-CA/XG溶膠(圖1a)經(jīng)過冷卻形成了半透明的復合凝膠(圖1b)；若在к-CA/XG溶膠體系中加入少量LVFX，可以得到載藥凝膠(圖1c)。另一個試驗表明，單獨的к-CA溶膠冷卻后形成凝膠的最低濃度不能低于2.0wt%，這與Iijima等[16]研究結(jié)果是一致的。而復合凝膠體系中，我們采用к-CA/XG質(zhì)量配比7∶3，總濃度4.0wt%，足以形成穩(wěn)定的典型凝膠體系(見1.2部分)。采用65℃加熱條件，能夠使多糖形成線狀的線圈高分子溶液[17]，但過高的溫度不利于所載藥物穩(wěn)定存在。к-CA原料中的KCl含量為K+5.23%，有利于凝膠的形成[18]。試驗表明，所載藥物LVFX不利于凝膠的形成，但16μg/ml的LVFX濃度足以滿足抑菌試驗要求。

圖1 一定條件下к-CA/XG復合凝膠體系的相變過程

2.2 凝膠的微觀形貌

鮮凝膠具有光滑和連續(xù)的表面(圖2a)，無任何裂縫，說明復合凝膠具有一個黏性的基質(zhì)，兩種多糖分子構(gòu)筑了持續(xù)穩(wěn)定的混合體系，大量水分子被捕獲和吸附在凝膠網(wǎng)絡(luò)中。然而，SEM可以觀察到干凝膠纖維狀紋理為主的多形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖2b,c,d)。首先，復合凝膠的表面呈現(xiàn)了一些帶狀和層狀結(jié)構(gòu)(圖2b)，這是去除溶劑水之后所暴露的凝膠真實情況。帶狀結(jié)構(gòu)寬度0.5～1.0μm且長度約3.0μm，它們被黏附在凝膠表層保住水分，也保護內(nèi)部結(jié)構(gòu)。我們推斷，這可能是兩種多糖分子鏈交織形成的螺旋狀結(jié)構(gòu)的聚集體。從圖2c和圖2d可以更清晰地觀察到不同角度剛性纖維狀的凝膠基質(zhì)斷面，主要是由к-CA形成的凝膠骨架結(jié)構(gòu)。這是體系在溶膠狀態(tài)下隨機地、以不同膠凝速率進行凝膠化的結(jié)果[16]。這些纖維之間的間隙，為裝載藥物分子提供了空間。由于添加的藥物量很小，載藥凝膠的形貌和結(jié)構(gòu)沒有受到影響，依然保持著空白凝膠的結(jié)構(gòu)形貌。

圖2 к-CA/XG復合凝膠的光學顯微鏡與掃描電鏡圖

2.3 凝膠的流變學性質(zhì)

復合凝膠樣品的流變學測量，按正弦剪切模式提供了儲能模量(G’)和耗能模量(G”)。在頻率掃描測試中(圖3a)，在1Pa的外加應力條件下，復合凝膠樣品的G’和G”值隨著頻率的增加有輕微的增長。因此，某種程度上，該復合凝膠仍呈現(xiàn)出弱凝膠的性質(zhì)[3]。這可能是由于凝膠中黃原膠側(cè)鏈參與影響的結(jié)果。但是，在整個頻率掃描過程中，隨著掃描頻率越來越大，G’>G”是保持不變的。這說明復合凝膠中多糖分子鏈被剪切形變釋放的能量更多的轉(zhuǎn)化并儲存成彈性形變，在黏性流動中損失較少，表現(xiàn)出正常的凝膠特性。在振幅掃描測試過程中(圖3b)，在頻率1Hz下以指數(shù)形式施加應力，復合凝膠結(jié)構(gòu)的應力屈服值只有25Pa左右，這說明黃原膠分子的參與使得復合凝膠成為一個柔軟、富有黏彈性的膠狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這可能更有利于藥物的吸附和控制釋放。

注：a.頻率掃描圖；b.振幅掃描圖

圖3 к-CA/XG復合凝膠的動態(tài)流變圖

2.4 凝膠微結(jié)構(gòu)

復合凝膠內(nèi)部分子的官能團之間的相互作用情況可以由紅外光譜來反映。首先，3100cm-1～3500cm-1之間的吸收帶歸屬為多糖分子內(nèi)O-H鍵的伸縮振動吸收(圖4)。復合凝膠干樣品呈現(xiàn)3392cm-1的吸收(圖4a)反映了к-CA/XG混合體系中兩種多糖分子的-OH之間氫鍵作用(圖5)。因為這是к-CA分子O-H鍵的3376cm-1吸收(圖4b)與XG分子O-H鍵的3427cm-1吸收遷移所致[19-20]，即兩個к-CA分子之間O-H氫鍵弱化而к-CA分子與XG分子之間O-H氫鍵增強。此外，XG的原料圖4c中，兩個吸收峰1718cm-1和1419cm-1可歸屬為-COO-基團中C=O的不對稱伸縮振動和C-O對稱振動吸收[21-22]，但在干凝膠樣品吸收中后者發(fā)生紅移至1406cm-1的位置(圖4a)。這很有可能是XG分子中-COO-基團通過K+-離子橋(圖5)與к-CA分子發(fā)生了作用[8,23]。比較圖4a和圖4b，846cm-1吸收峰歸屬為半乳糖-4-硫酸基中糖環(huán)C4-OSO3-鍵的吸收，形成凝膠前后這個C-O鍵的846cm-1吸收未受影響，說明K+-離子橋不會完全通過硫酸基結(jié)合[24]，也有可能通過3,6-內(nèi)醚的氧原子結(jié)合(圖5)，甚至部分硫酸基還未被XG分子打擾。因為從к-CA原料(圖4b)到干凝膠(圖4a)，硫酸基中S=O鍵的1157cm-1吸收[25]，以及3,6-內(nèi)醚的929cm-1吸收[26]，均發(fā)生很小的遷移現(xiàn)象。通過以上分析，我們可以推斷к-CA分子與XG分子之間的作用力，主要是氫鍵作用和K+-離子橋(圖5)，這有助于我們理解兩種多糖分子之間的物理交聯(lián)所形成凝膠的微結(jié)構(gòu)及其形成機制。另外，載藥凝膠中，因為載藥量甚微，藥物分子的紅外吸收峰被凝膠基質(zhì)掩蓋。

注：a.к-CA/XG復合干凝膠；b.к-CA原料；c.XG原料

圖5 復合凝膠內(nèi)部к-CA/XG分子之間的氫鍵
作用(虛線)和K+-離子橋(斑點線)示意圖

2.5 X射線粉末衍射(XRD)譜圖

在к-CA原料中，呈現(xiàn)以2θ=20°為中心的一個寬泛峰值，表明к-CA原料是無定形狀態(tài)[27-28]。к-CA原料還有一個明顯的2θ=28.4°尖峰，這是原料中無機鹽KCl晶體的存在，而非卡拉膠本身結(jié)構(gòu)造成的[27-28](圖6a)。形成復合凝膠后，2θ=28.4°的尖峰基本消失了(圖6b)。這說明K+不再以無機鹽形式存在，而是被溶解后參與了兩個多糖分子間的結(jié)合位點以形成凝膠。另一個原料XG，也呈現(xiàn)出一個寬泛2θ=21°峰(圖6c)，表明了它的無定形結(jié)構(gòu)[29]。以此為基礎(chǔ)所形成的復合凝膠(圖6b)，也只有一個寬泛2θ=20.2°峰，說明復合凝膠也是無定形結(jié)構(gòu)，并沒有十分有序的新結(jié)構(gòu)形成。

注：a.к-CA原料；b.к-CA/XG復合干凝膠；c.XG原料

圖6 к-CA/XG復合凝膠及其原料的XRD圖譜對比

2.6 載藥凝膠的抗菌測試效果

利用革蘭陽性金黃色葡萄球菌和革蘭陰性大腸埃希氏菌為模型菌株，自制的牛津杯法測試LVFX載藥凝膠的抑菌效果，所得載藥凝膠的斑點區(qū)抑菌圈增長情況拍照如圖7。我們觀察到，無論是對于金黃色葡萄球菌(圖7a)還是對于大腸埃希氏菌(圖7b)，載藥凝膠斑點周圍都出現(xiàn)了十分清晰抑菌圈。而同樣條件下，未加LVFX的空白凝膠斑點周圍則存在密集的細菌菌落。對于金黃色葡萄球菌(圖8a)的作用，載藥凝膠斑點周圍呈現(xiàn)的抑菌圈直徑相對于陽性對照物來說達到50%；對于大腸埃希氏菌(圖8b)的作用，載藥凝膠斑點周圍呈現(xiàn)的抑菌圈直徑相對于陽性對照物的作用達到46%。這些現(xiàn)象表明，к-CA/XG復合凝膠本身沒有抑菌作用，而裝載了LVFX的載藥凝膠直接地表現(xiàn)出抑菌效果。因此，新獲得的к-CA/XG復合凝膠可以應用于抗菌藥物的制劑工業(yè)生產(chǎn)。

注：a. 金黃色葡萄球菌；b. 大腸埃希氏菌；與載藥凝膠中同濃度LVFX溶液作陽性對照，37℃下培育24h

注：a.金黃色葡萄球菌；b.大腸埃希氏菌；陽性對照
為相同濃度LVFX溶液

圖8 к-CA/XG載藥凝膠和空白凝膠抑制菌株
的抑菌圈定量分析

3 結(jié)論

利用廉價易得、生物兼容的天然多糖к-CA和XG做原料，可以開發(fā)研究新型的復合凝膠。研究表明，к-CA/XG復合凝膠中兩種多糖分子之間主要以氫鍵和離子橋相結(jié)合，形成帶狀或纖維狀紋理的微結(jié)構(gòu)形貌、表現(xiàn)為弱凝膠的流變學特性等。к-CA/XG復合凝膠是一種良好的藥物載體，將к-CA/XG復合凝膠應用于制作抗菌藥物制劑，取得了明顯的抗菌效果。