田 甜，余 蕾，謝汝佳，韓 冰，丁凱澤，楊 勤△，楊 雪

（1貴陽市婦幼保健院優(yōu)生遺傳科，2貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，3貴陽市婦幼保健院病理科，4貴陽市婦幼保健院生殖中心，貴州貴陽550004）

組蛋白賴氨酸（lysine，K）甲基化是一種表觀遺傳修飾方式，與組蛋白乙酰化修飾不同，它并不影響組蛋白尾上賴氨酸的電荷數(shù)，但會(huì)造成空間位阻，導(dǎo)致賴氨酸的疏水性變化，形成新的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，從而廣泛參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［1］。組蛋白H3賴氨酸殘基上能夠發(fā)生甲基化修飾的位點(diǎn)有很多，比如H3K4、H3K9、H3K27等；這些組蛋白甲基化修飾對(duì)基因表達(dá)的影響不盡相同，例如H3K4二甲基化（H3K4 dimethylation，H3K4me2）具有促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄起始的作用，而H3K9二甲基化（H3K9 dimethylation，H3K9me2）具有抑制基因轉(zhuǎn)錄起始的作用［2］。

通過抑制肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）增殖、活化以及調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成和代謝之間的平衡逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，一直是抗肝纖維化治療的研究熱點(diǎn)［3］。有文獻(xiàn)報(bào)道，靶向改變HSC中異常的組蛋白甲基化狀態(tài)，能夠抑制HSC的增殖和活化，從而抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。Yang等［4］發(fā)現(xiàn)組蛋白H3K27甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑DZNep通過降低HSC-T6細(xì)胞中Dickkopf1（DKK1）基因啟動(dòng)子區(qū)H3K27的甲基化水平，導(dǎo)致DKK1蛋白表達(dá)上調(diào)。DKK1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑，其蛋白表達(dá)上調(diào)會(huì)阻斷Wnt/βcatenin信號(hào)通路，抑制HSC的增殖和活化。上述研究提示組蛋白H3K27甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑DZNep通過改變HSC中異常修飾的H3K27甲基化，表現(xiàn)出抗肝纖維化作用，表明利用抑制劑或siRNA靶向改變激活型HSC中異常的組蛋白甲基化狀態(tài)可以抑制HSC的增殖和活化。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在HSC活化過程中H3K9甲基化水平降低［5］，但是關(guān)于采用組蛋白H3K9去甲基化酶抑制劑改變激活型HSC中H3K9甲基化修飾對(duì)HSC增殖、活化以及ECM合成和代謝影響的研究，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。

IOX1（5-羧基-8-羥基喹啉，5-carboxy-8-hydroxyquinoline）是新發(fā)現(xiàn)的一種以8-羥基喹啉為基礎(chǔ)的強(qiáng)效組蛋白去甲基化酶抑制劑，它能夠與組蛋白H3K9去甲基化酶活性中心的Fe（II）螯合，使去甲基化過程中單電子傳遞障礙，甲基不能發(fā)生羥基化，從而導(dǎo)致細(xì)胞中H3K9甲基化水平增加［6］。但目前應(yīng)用IOX1防治疾病的研究，鮮有報(bào)道。有研究采用IOX1刺激血管緊張素Ⅱ預(yù)處理的血管平滑肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白D1基因啟動(dòng)子區(qū)H3K9甲基化富集量增加，細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)被抑制，由于細(xì)胞周期蛋白D1與細(xì)胞增殖有關(guān)，其表達(dá)下降可導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，因此研究者認(rèn)為IOX1可通過抑制細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)而抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用［7］。組蛋白H3K9去甲基化酶抑制劑可上調(diào)激活型HSC細(xì)胞中H3K9me2水平，但是否能夠抑制HSC的增殖和活化，減少ECM沉積呢？相關(guān)的研究目前尚未見報(bào)道。鑒于此，本研究擬通過IOX1處理轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）誘導(dǎo)活化的人HSC細(xì)胞株LX2，觀察IOX1調(diào)控H3K9me2修飾對(duì)LX2細(xì)胞增殖、凋亡以及ECM相關(guān)蛋白［α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型膠原（collagen type I，Col I）、基質(zhì)金屬蛋白酶 1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）和金屬蛋白酶組織抑制物 1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）］表達(dá)的影響。

材料和方法

1 材料

人肝星狀細(xì)胞株LX2購自上海細(xì)胞庫。IOX1和DMSO購自Sigma；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco）；胰酶和彩虹Marker（北京索萊寶科技有限公司）；細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑和BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物科技有限公司）；annexin VFITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司）；抗β-actin抗體、抗組蛋白H3抗體、山羊抗兔IgG+H以及兔抗H3K9me2、α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1抗體購自Abcam。

2 主要方法

2.1 LX2細(xì)胞活化 本實(shí)驗(yàn)所用LX2細(xì)胞均經(jīng)過5 μg/L TGF-β誘導(dǎo)而活化，在此基礎(chǔ)上加入不同濃度的IOX1處理。

2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)（real-time cellular analysis，RTCA）檢測不同濃度IOX1對(duì)LX2細(xì)胞增殖的影響。RTCA系統(tǒng)通過EPlate底部的電極檢測貼壁細(xì)胞的電阻抗，可反映細(xì)胞的數(shù)量、活力、形態(tài)以及貼壁情況，以細(xì)胞指數(shù)（cell index，CI）作為檢測指標(biāo)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔5×103個(gè)的密度接種于EPlate，10 h后分別加入終濃度為50、100、200和400 μmol/L的IOX1處理細(xì)胞，對(duì)照組不予處理，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測72 h，觀察不同濃度IOX1對(duì)LX2細(xì)胞增殖的影響，每15 min記錄1次。經(jīng)過RTCA軟件分析得出CI值。根據(jù)RTCA實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中IOX1的給藥濃度。

2.3 倒置顯微鏡觀察LX2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化 取對(duì)數(shù)生長期的活化LX2細(xì)胞，細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組（control組，不予IOX1處理）、50 μmol/L IOX1組、100 μmol/L IOX1組及300 μmol/L IOX1組（IOX1給藥濃度由RTCA實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定）。觀察不同濃度IOX1處理IOX1細(xì)胞24 h后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測LX2細(xì)胞凋亡情況 取對(duì)數(shù)生長期的活化LX2細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，在每個(gè)無包被的塑料皿（10 cm）中鋪1×106個(gè)細(xì)胞，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組（不予IOX1處理）、50 μmol/L IOX1組、100 μmol/L IOX1組及 300 μmol/L IOX1組。給藥24 h后用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，制備密度為1×108/L的細(xì)胞懸液，取1 mL離心，除去上清液，加入annexin V-FITC結(jié)合液195 μL重懸，再先后加入annexin V-FITC 5 μL和PI染色液10 μL，在室溫下避光孵育20 min后置于冰浴中，流式細(xì)胞儀檢測。

2.5 Western blot檢測LX2細(xì)胞中組蛋白H3K9me2水平以及 α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1蛋白水平 收集各組細(xì)胞，分別加入蛋白裂解液，冰上裂解10 min，收集細(xì)胞懸液，超聲破碎，12 000 r/min、4℃離心20 min，棄沉淀，收集上清，使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取40 μg總蛋白上樣，行SDSPAGE，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉90 min，分別加入1∶1 500稀釋的兔抗α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1抗體，以及1∶5 000稀釋的兔抗H3K9me2抗體，4℃搖床孵育過夜。第2天用TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶4 000），室溫孵育90 min，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光成像，分別以β-actin和組蛋白H3為內(nèi)參照。用Image Lab圖像分析軟件對(duì)每個(gè)條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞增殖結(jié)果

任意接種密度下的LX2細(xì)胞在接種5 h內(nèi)，CI會(huì)快速達(dá)到最大值，到10 h時(shí)CI又降低，隨后細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇在細(xì)胞接種10 h后再加入不同濃度IOX1處理。細(xì)胞接種密度在每孔2×104和1×104個(gè)細(xì)胞時(shí)，CI分別在20和40 h時(shí)就已達(dá)到最大，并在此之后逐漸下降；而在每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種密度下，CI在60 h時(shí)仍處于生長旺盛期，見圖1A。因此，我們確定以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的接種密度進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。

接種LX2細(xì)胞10 h后，分別加入不同濃度的IOX1，持續(xù)檢測72 h。RTCA結(jié)果顯示，和對(duì)照組相比，不同濃度IOX1對(duì)LX2細(xì)胞增殖的影響表現(xiàn)為先促進(jìn)后抑制，且IOX1濃度越大，抑制細(xì)胞增殖的作用越明顯，見圖1B。

根據(jù)LX2細(xì)胞的增殖曲線，我們得到IOX1處理LX2細(xì)胞24 h所對(duì)應(yīng)的IC50曲線（圖1C），算得IOX1處理24 h的IC50為150 μmol/L。因此我們選取50、100和300 μmol/L IOX1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 倒置顯微鏡觀察不同濃度IOX1處理的LX2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

和對(duì)照組相比，50 μmol/L IOX1處理LX2細(xì)胞24 h后細(xì)胞形態(tài)沒有明顯變化；在100 μmol/L IOX1組和300 μmol/L IOX1組中可見細(xì)胞開始皺縮，胞膜不完整，部分細(xì)胞甚至出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，見圖2。

3 不同濃度IOX1處理的LX2細(xì)胞的凋亡情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度IOX1處理24 h后LX2細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，50和100 μmol/L IOX1對(duì)LX2細(xì)胞凋亡無明顯影響（P＞0.05），而300 μmol/L組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯增加（P＜0.05），見圖3。

4 IOX1處理LX2細(xì)胞后H3K9me2、α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1蛋白水平

與對(duì)照組相比，50、100和300 μmol/L IOX1組中H3K9me2水平明顯提高，表現(xiàn)出濃度依賴性（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，50和100 μmol/L IOX1組中α-SMA和TIMP-1的表達(dá)沒有明顯差異（P＞0.05），但在300 μmol/L IOX1組α-SMA和TIMP-1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低（P＜0.05）；與對(duì)照組和50 μmol/L IOX1組相比，Col I蛋白在100和300 μmol/L IOX1組中表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，50、100和300 μmol/L IOX1組中MMP-1蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05），且呈劑量依賴性特點(diǎn)，見圖4。

討 論

HSC位于肝細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞之間的Disse腔隙中，其在生理狀態(tài)下的主要功能是儲(chǔ)存和代謝維生素A，因而又稱儲(chǔ)脂細(xì)胞。病理狀態(tài)下，HSC的形態(tài)和功能均發(fā)生改變，HSC失去脂質(zhì)表型并開始合成ECM，ECM的合成增多而降解又相對(duì)不足，造成ECM的大量沉積，這一過程被稱為HSC的活化，因此，HSC的活化被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［8］。TGF-β是目前已知最強(qiáng)的促肝纖維化發(fā)生的細(xì)胞因子，它通過TGF-β/Smad信號(hào)通路激活HSC，使HSC中ECM合成增加并改變ECM代謝，從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展［9］。在本研究中，我們采用活化的人HSC細(xì)胞株LX2作為研究對(duì)象，為保證LX2活化的均衡性，我們用TGF-β刺激LX2細(xì)胞活化，在此基礎(chǔ)上采用IOX1干預(yù)TGF-β預(yù)處理活化的LX2細(xì)胞，觀察IOX1對(duì)LX2細(xì)胞H3K9甲基化修飾的改變及對(duì)細(xì)胞活化和ECM代謝的影響。

Figure 3.Apoptosis of LX2 cells treated with IOX1 at different concentrations.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；&P＜0.05 vs 50 μmol/L IOX1 group；#P＜0.05 vs 100 μmol/L IOX1 group.圖3 不同濃度IOX1處理的LX2細(xì)胞的凋亡情況

Figure 4.The protein levels of H3K9me2，α-SMA，Col I，MMP-1 and TIMP-1 in the LX2 cells exposed to IOX1 at different concentrations.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；&P＜0.05 vs 50 μmol/L IOX1 group；#P＜0.05 vs 100 μmol/L IOX1 group.圖4 IOX1處理的LX2細(xì)胞中H3K9me2、α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1蛋白水平的變化

RTCA和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，IOX1一方面能夠抑制LX2細(xì)胞增殖，另一方面明顯促進(jìn)LX2細(xì)胞凋亡。已有大量研究證實(shí)，減少活化的HSC，或者促進(jìn)活化的HSC細(xì)胞發(fā)生凋亡能夠有效抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，促HSC凋亡的藥物具有抗肝纖維化作用。因此，我們推測IOX1可能通過抑制HSC增殖、促進(jìn)HSC凋亡而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

IOX1作為一種組蛋白去甲基化酶抑制劑，能夠上調(diào)細(xì)胞中H3K9甲基化水平。本研究發(fā)現(xiàn)IOX1可顯著提高TGF-β誘導(dǎo)的LX2細(xì)胞中H3K9me2水平，且呈劑量依賴性。α-SMA的表達(dá)被看作HSC活化的標(biāo)志物，且活化的HSC表達(dá)大量以Col I為主的ECM［10-11］，故抑制HSC活化和減少ECM合成被認(rèn)為是治療肝纖維化的有效策略。本研究中Western blot結(jié)果顯示，IOX1可抑制α-SMA和Col I蛋白表達(dá)。通常，H3K9me2水平提高會(huì)抑制基因的表達(dá)。因此，我們推測IOX1可能通過上調(diào)編碼α-SMA和Col I蛋白的基因啟動(dòng)子區(qū)H3K9me2水平而抑制α-SMA和Col I蛋白表達(dá)。此外，HSC活化過程中ECM合成增加并不是ECM沉積的全部因素，ECM降解減少在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起了更為關(guān)鍵的作用。MMP-1能夠降解以膠原為主的ECM，其活性又受到TIMP-1的抑制［12-13］。本研究中Western blot結(jié)果顯示，IOX1能夠促進(jìn)細(xì)胞中MMP-1蛋白表達(dá)，抑制TIMP-1蛋白表達(dá)。這表明IOX1可糾正MMP-1和TIMP-1之間的失衡，促進(jìn)ECM的降解，有效抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。但是IOX1是否通過H3K9me2調(diào)控MMP-1和TIMP-1的表達(dá)，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，組蛋白去甲基化酶抑制劑IOX1能夠抑制HSC增殖，促進(jìn)HSC凋亡，減少ECM合成，促進(jìn)ECM降解。IOX1可能通過H3K9me2調(diào)控α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1的表達(dá)，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。