王曉芳 于丹 劉春英

[摘要]目的 研究黃芪建中湯含藥血清聯(lián)合順鉑對人肺癌A549細(xì)胞的作用及其對E-cadherin、Snail1表達(dá)的影響。方法 黃芪建中湯含藥血清聯(lián)合不同濃度順鉑（0、2、4、8、16、32、64 μg/ml）培養(yǎng)A549細(xì)胞株48 h，采用四唑鹽比色（MTT）法檢測細(xì)胞株的增殖抑制率，確定聯(lián)合順鉑的最佳用藥濃度。將A549細(xì)胞株隨機(jī)分為4組，即空白組、中藥組、順鉑組、聯(lián)合組，依次用完全培養(yǎng)基、黃芪建中湯含藥血清、順鉑、黃芪建中湯含藥血清聯(lián)合順鉑干預(yù)。各組細(xì)胞株培養(yǎng)48 h后，進(jìn)一步采用MTT法檢測各組細(xì)胞株的增殖抑制率。再通過免疫細(xì)胞化學(xué)法（IHC）、免疫蛋白印跡（WB）法檢測各組細(xì)胞株E-cadherin、Snail1蛋白的表達(dá)。最后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測各組細(xì)胞株E-cadherin、Snail1基因的表達(dá)。結(jié)果 MTT法研究顯示，聯(lián)合用藥時(shí)順鉑的最佳濃度為8 μg/ml;聯(lián)合組A549細(xì)胞株增殖抑制率高于順鉑組、中藥組、空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。IHC和WB法研究顯示，聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的E-cadherin蛋白表達(dá)水平高于順鉑組、中藥組、空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的Snail1蛋白表達(dá)水平低于順鉑組、中藥組、空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。RT-PCR法研究顯示，聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的E-cadherin基因表達(dá)水平高于順鉑組、中藥組、空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的Snail1基因表達(dá)水平低于順鉑組、中藥組、空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 黃芪建中湯含藥血清聯(lián)合順鉑能夠抑制A549細(xì)胞株的增殖，增強(qiáng)人肺癌A549細(xì)胞株中E-cadherin蛋白、基因的表達(dá)，并降低人肺癌A549細(xì)胞株中Snail1蛋白、基因的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]肺癌;A549細(xì)胞;黃芪建中湯;順鉑;E-cadherin;Snail1

[中圖分類號] R273? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）4（a）-0004-06

[Abstract] Objective To study the effect of serum containing Huangqi Jianzhong Decoction combined with Cisplatin on A549 cell proliferation and expression of E-cadherin and Snail1 in human lung cancer. Methods A549 cell lines were cultured for 48 h with the serum containing Huangqi Jianzhong Decoction combined with different concentrations of Cisplatin （0， 2， 4， 8， 16， 32， 64 μg/ml）. Magnetic Tape Terminal （MTT） was used to detect the proliferation inhibition rate of A549 cell lines and determine the optimal concentration of Cisplatin. A549 cell lines were randomly divided into four groups： blank group， traditional Chinese medicine group， Cisplatin group and combination group， in which complete medium， serum containing Huangqi Jianzhong Decoction， Cisplatin， serum containing Huangqi Jianzhong Decoction and Cisplatin were successively used for intervention. After A549 cell lines were cultured for 48 h， the proliferation inhibition rate of A549 cell lines in each group was further detected by MTT. The protein expression levels of E-cadherin and Snail1 in each group were determined by immunohistochemistry （IHC） and Western Blot （WB）. The gene expression levels of E-cadherin and Snail1 were determined by realtime-PCR （RT-PCR）. Results The research of MTT method showed that the optimal concentration of Cisplatin in combination was 8 μg/ml. The inhibition rate of A549 cell lines in the combination group was higher than that in the Cisplatin group， the traditional Chinese medicine group and the blank group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The research of IHC and WB method showed that the expression level of E-cadherin protein of A549 cell lines in the combination group was higher than that in the Cisplatin group， the traditional Chinese medicine group and the blank group， the differences were statistically significant （P<0.05）. And the expression level of the Snail1 protein of A549 cell lines in the combination group was lower than that in the Cisplatin group， the traditional Chinese medicine group and the blank group， with statistically significant differences （P<0.05）. The research of RT-PCR method showed that the gene expression level of E-cadherin of the A549 cell lines in the combination group was higher than that in the Cisplatin group， the traditional Chinese medicine group and the blank group， with statistically significant differences （P<0.05）. The gene expression level of the Snail1 in the A549 cell lines of the combination group was lower than that of the Cisplatin group， the traditional Chinese medicine group and the blank group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Serum containing Huangqi Jianzhong Decoction combined with Cisplatin can inhibit the proliferation of A549 cell lines， enhance the expression of E-cadherin protein and gene in A549 cells line of human lung cancer， and reduce the expression of Snail1 protein and gene in A549 cells line of human lung cancer.

[Key words] Lung cancer; A549 cells; Huangqi Jianzhong Decoction; Cisplatin; E-cadherin; Snail1

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，每年約一百萬人死于肺癌，其中約80%的肺癌患者死于侵襲和轉(zhuǎn)移[1-2]。由于肺癌早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者在接受治療時(shí)，已經(jīng)處于中晚期以致錯(cuò)失手術(shù)最佳治療時(shí)期，肺癌治療方案有外科手術(shù)、放射療法、化學(xué)治療、靶向治療，其中靶向治療是其主要的治療方法之一[3-4]。靶向治療能夠有效延長患者的壽命，但其創(chuàng)傷大，造成患者免疫力降低，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，因此探究肺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制以及新的治療方法成為新趨勢[5-6]。肺癌晚期患者，有消瘦、乏力、精神萎靡、倦怠的脾虛癥狀，說明“脾氣虛”對肺癌發(fā)展有重要影響，其治療當(dāng)以培補(bǔ)脾氣為本[7-9]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃芪建中湯可通過其益氣健脾作用來改善機(jī)體的免疫功能，從而抑制腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[4]，對中醫(yī)藥改善腫瘤微環(huán)境影響的機(jī)制研究具有重要意義。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，順鉑可以抑制A549細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移，黃芪建中湯含藥血清可以抑制A549細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移[5]。本研究通過檢測藥物對A549細(xì)胞增殖抑制率的影響及檢測細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、Snail1蛋白和基因的表達(dá)水平，探討黃芪建中湯含藥血清聯(lián)合順鉑抑制人肺癌A549細(xì)胞的增殖作用及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

1.1.1細(xì)胞株? 人肺癌A549細(xì)胞株購自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器? 胎牛血清（S-FBS-015）購于SERANA公司;0.25%胰蛋白酶（SH30042.01）購于HyClone公司;雙抗（SV30010）購于HyClone公司;RPMI-1640培養(yǎng)基（SH30809.01）購于HyClone公司;PBS（AC13716274）購于HyClone公司;順鉑粉劑（Y27N8C49197）購于上海源葉生物科技有限公司;四唑鹽比色（MTT）細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（M1020）購于Solarbio有限公司;免疫組化試劑盒SABC即用型（SA1020）購于博士德生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒（PC0020）購于Solarbio有限公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（P1200）購于Solarbio有限公司;TBS緩沖液（BL602A）購于biosharp公司;Tween-20（T8220）購于Solarbio有限公司;M5 Total RNA Extraction Reagent（MF034-01）購于Mei5有限公司;β-actin（A01010）、E-cadherion（ABP51221）和Snail1（ABP52472）抗體購于Abbkine有限公司;水平搖床（TDK-2）購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;酶標(biāo)儀（ELX800）購于美國伯騰儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1 A549細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組處理? 人肺癌A549細(xì)胞株在37℃、濕度95%、5% CO2的恒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)液中含15%胎牛血清、1%雙抗，2 d換液，3 d 0.25%胰酶進(jìn)行消化并傳代。待A549細(xì)胞貼壁生長密度達(dá)到70%后，將其隨機(jī)分為4組：空白組（A549+完全培養(yǎng)基）、中藥組（A549+黃芪建中湯含藥血清）、順鉑組（A549+順鉑）、聯(lián)合組（A549+黃芪建中湯含藥血清+順鉑）。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪建中湯最佳濃度含藥血清為含生藥1.148 kg/ml，最佳作用時(shí)間為48 h[5]。

1.2.2 MTT法檢測A549細(xì)胞株的抑制率? 將對數(shù)期生長的A549細(xì)胞去除培養(yǎng)基，0.25%胰酶、37℃消化5 min，制成單細(xì)胞懸液105/ml，接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，分別用完全培養(yǎng)基（空白組）和濃度為0、2、4、8、16、32、64 μg/ml的順鉑聯(lián)合黃芪建中湯含藥血清處理，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出，吸去上清，每孔加20 μl的MTT溶液，37℃培養(yǎng)4 h后，去除廢液，加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），水平搖床避光震蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm測量吸光度（OD）值（A），選出聯(lián)合用藥中最適順鉑濃度。根據(jù)常用公式：細(xì)胞生長抑制率（IR，%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組A平均值-空白對照組A均值）/（細(xì)胞對照組A均值-空白對照組A均值）]×100%[4]。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3免疫細(xì)胞化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）法檢測E-cadherin、Snail1蛋白的表達(dá)? 細(xì)胞鋪片，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)的處理因素培養(yǎng)48 h后取出，室溫固定、通透，3% H2O2室溫孵育10 min，5% 牛血清清蛋白（BSA）封閉，實(shí)驗(yàn)組分別加入一抗[E-cadherin（1∶200稀釋）和Snail1（1∶200稀釋）]4℃過夜，次日，生物素化二抗10 min，鏈霉菌抗生素-過氧化物酶處理10 min，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素染色，1%鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，采用Image-pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析。

1.2.4免疫蛋白印跡（Weatern Blot，WB）法檢測E-cadherin、snail1蛋白的表達(dá)? 取出根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)的處理因素培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用預(yù)冷的PBS清洗后，加細(xì)胞裂解液100 μl反復(fù)吹打使其充分接觸細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解產(chǎn)物，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA蛋白濃度測定，100℃變性5 min，-20℃保存待用。灌制SDS-聚丙烯酰胺凝膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)印液轉(zhuǎn)膜后，立春紅染液檢驗(yàn)，TBST清洗10 min，封閉液封閉2 h，一抗[E-cadherin（1∶800稀釋）和Snail1（1∶800稀釋）]4℃孵育過夜，二抗室溫水平震蕩1 h，TBST清洗10 min，配置熒光顯色劑，Tanon凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。用AlPhaview SA軟件測量各個(gè)條帶的吸光度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測E-cadherin和Snail1基因的表達(dá)? 引物由武漢金開瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)，所用的引物序列如下。E-cadherin上游引物：5′-TCAAGGTGAGGGGTTAAGCAC-3′，下游引物：5′-CGACGTTAGCCTCGTTCTCA-3′;snail1上游引物：5′-CCAGACCCACTCAGATGTCA-3′，下游引物：5′-GGACTCTTGGTGCTTGTGGA-3′;β-actin上游引物：5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′，下游引物：5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3′。取出根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組給予處理因素培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，分別提取各組A549細(xì)胞株的總RNA（按照M5 TotalRNA Extraction Reagent提取步驟），檢測樣本RNA的濃度，計(jì)算RNA濃度（μg/μl）=OD260×40×稀釋倍數(shù)/1000。合成cDNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明，反應(yīng)條件為37℃ 15min，98℃ 5 min，一個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95℃ 1 min，一個(gè)循環(huán);95℃ 15 s，60℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán);95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s。7500RT-PCR系統(tǒng)檢測，計(jì)算相對值（ratio）=2-△△CT。

1.3觀察指標(biāo)

檢測黃芪建中湯含藥血清聯(lián)合不同濃度順鉑對人肺癌A549細(xì)胞OD值并計(jì)算細(xì)胞株的增殖抑制率。通過轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平檢測黃芪建中湯含藥血清聯(lián)合順鉑作用于A549細(xì)胞株時(shí)，E-cadherin蛋白、基因的表達(dá)以及Snail1蛋白、基因的表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1黃芪建中湯含藥血清聯(lián)合不同濃度順鉑對A549細(xì)胞增殖的影響

采用MTT法檢測黃芪建中湯含藥血清（生藥量為1.148 kg/ml）中聯(lián)合不同濃度的順鉑對A549細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果見圖1，當(dāng)順鉑濃度達(dá)到8 μg/ml時(shí)，對A549細(xì)胞株增殖的抑制作用達(dá)最佳效果，因此本實(shí)驗(yàn)采用8 μg/ml的順鉑作為聯(lián)合給藥組用藥濃度。進(jìn)一步檢測結(jié)果顯示，中藥組[（8.11±6.78）%]、順鉑組[（18.35±1.03）%]和聯(lián)合組[（18.84±4.47）%]對A549細(xì)胞株的抑制率均高于空白組[（0.00±0.00）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;順鉑組對A549細(xì)胞株的抑制率高于中藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;聯(lián)合組對A549細(xì)胞株的抑制率高于中藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;聯(lián)合組對A549細(xì)胞株的抑制率高于順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示本實(shí)驗(yàn)中黃芪建中湯含藥血清聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞株增殖有抑制作用，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供有力理論依據(jù)。

2.2 IHC法檢測各組A549細(xì)胞株中E-cadherin、Snail1蛋白表達(dá)的情況

各組細(xì)胞中E-cadherin陽性表達(dá)多在細(xì)胞膜[10]，Snail1陽性多表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)[11]，呈棕黃色顆粒著色。聯(lián)合組、順鉑組、中藥組A549細(xì)胞株中的E-cadherin蛋白表達(dá)水平均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;聯(lián)合組、順鉑組A549細(xì)胞株中的E-cadherin蛋白表達(dá)水平均高于中藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的E-cadherin蛋白表達(dá)水平高于順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖2，封三、表1）。聯(lián)合組、順鉑組、中藥組A549細(xì)胞株中的Snail1蛋白表達(dá)水平均低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;聯(lián)合組、順鉑組A549細(xì)胞株中的Snail1蛋白表達(dá)水平均低于中藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的Snail1蛋白表達(dá)水平低于順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖3，封三、表1）。

2.3 WB法檢測各組A549細(xì)胞株中E-cadhern、Snail1蛋白表達(dá)的情況

中藥組、順鉑組和聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的E-cadherin蛋白表達(dá)水平均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;順鉑組和聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的E-cadherin蛋白表達(dá)水平均高于中藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的E-cadherin蛋白表達(dá)水平高于順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。中藥組、順鉑組和聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的Snail1蛋白表達(dá)水平均低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;順鉑組和聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的Snail1蛋白表達(dá)水平均低于中藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的Snail1蛋白表達(dá)水平低于順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖4、表2）。

2.4 RT-PCR法檢測各組A549細(xì)胞株中E-cadherin、Snail1基因表達(dá)情況的比較

中藥組、順鉑組和聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的E-cadherin基因表達(dá)水平均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;順鉑組和聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的E-cadherin基因表達(dá)水平均高于中藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的E-cadherin基因表達(dá)水平高于順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。中藥組、順鉑組和聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的Snail1基因表達(dá)水平均低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;順鉑組和聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的Snail1基因表達(dá)水平均低于中藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;聯(lián)合組A549細(xì)胞株中的Snail1基因表達(dá)水平低于順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表3）。

3討論

中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)古籍中并沒有對“肺癌”這一病名的記載，現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肺癌涵蓋在中醫(yī)的“肺積”“肺脹”“痞疪”等疾病之中，是一種多因脾氣不足、正氣虧虛所致的疑難之病。中藥具有作用靶點(diǎn)多、不易耐藥的特點(diǎn)，可以調(diào)節(jié)肺癌免疫，其機(jī)制包括增強(qiáng)細(xì)胞毒性、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞的免疫監(jiān)視與殺傷作用[12]，在臨床診治中被許多醫(yī)家推崇應(yīng)用進(jìn)行治療肺癌。黃芪建中湯作為“培土生金法”的代表方之一，由黃芪、桂枝、芍藥、炙甘草、生姜、大棗、飴糖組成。方中黃芪入肺、脾二經(jīng)，合甘草、大棗補(bǔ)益脾氣，桂枝、生姜溫陽散寒，白芍緩急止痛，飴糖補(bǔ)脾緩急，各藥合用功能在于燮理陰陽，培補(bǔ)脾氣，是益氣健脾的代表方之一，可以有效改善消瘦、倦怠、乏力、精神萎靡等脾氣虛癥狀?，F(xiàn)代研究表明，益氣法可延長生存期、預(yù)防遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤增殖[13]。黃芪的提取物具有廣泛的抗癌作用，其中，作為重要提取成分之一的黃芪多糖能夠抑制荷瘤小鼠皮下黑色素瘤的生長，進(jìn)而增強(qiáng)小鼠T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤免疫活性[4]，為中醫(yī)在癌癥的診斷與治療方面提供理論依據(jù)。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（eithelial-mesenchymal transformation，EMT）是由某些生理或病理?xiàng)l件下引起的上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的分化過程，其在胚胎組織分化、傷口愈合、組織纖維化和癌癥進(jìn)展中起著重要作用，是惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志之一[14-15]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，通過改善EMT可以有效減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[16-17]。廣泛分布于上皮細(xì)胞的E-cadherin可以促進(jìn)細(xì)胞黏附聚集，維持上皮細(xì)胞的完整形態(tài)，也是外部信號傳導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)骨架的樞紐，對腫瘤細(xì)胞的接觸性依賴性生長起到抑制的功能。實(shí)驗(yàn)研究表明，降低或消除E-cadherin蛋白表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展、侵襲和預(yù)后不良有關(guān)[18]。Snail基因編碼Snail家族鋅指蛋白1，以鋅指轉(zhuǎn)錄因子1即Snail1著稱[6]，Snail1在腫瘤細(xì)胞中會促進(jìn)上皮細(xì)胞鈣黏蛋白降解，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[19-20]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Snail是誘導(dǎo)EMT的主要轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤發(fā)生過程中，腫瘤細(xì)胞在腫瘤和宿主之間的轉(zhuǎn)移和浸潤，主要由炎癥細(xì)胞因子通過Snail誘導(dǎo)EMT引起[6-7，21]。在組織或器官纖維化等疾病的EMT過程受多種機(jī)制調(diào)控，Snail1是其進(jìn)程中的關(guān)鍵性調(diào)控因子。它能夠與轉(zhuǎn)錄因子超家族成員有效結(jié)合，并且通過與E-box結(jié)合來直接抑制E-cadherin基因的表達(dá)，使得E-cadherin蛋白在上皮細(xì)胞的表達(dá)減少，在形態(tài)學(xué)上上皮細(xì)胞失去了極性，細(xì)胞之間的黏附作用降低，從而使腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)易轉(zhuǎn)移和易侵襲狀態(tài)[19-20]。E-cadherin和Snail1作為EMT發(fā)生的經(jīng)典標(biāo)志物，研究提示發(fā)生EMT時(shí)，都伴隨著E-cadherin蛋白表達(dá)的下調(diào)和Snail1蛋白表達(dá)的上調(diào)，逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生時(shí)，一般都伴隨著E-cadherin蛋白表達(dá)的升高及Snail1蛋白表達(dá)的下調(diào)[6-9]。

本實(shí)驗(yàn)對黃芪建中湯含藥血清聯(lián)合順鉑干預(yù)人肺癌A549細(xì)胞株進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，黃芪建中湯含藥血清聯(lián)合的順鉑最佳濃度為8 μg/ml，聯(lián)合用藥時(shí)人肺癌A549細(xì)胞株的增殖抑制作用增強(qiáng)，E-cadherin蛋白、基因表達(dá)增高，Snail1蛋白、基因表達(dá)降低。提示黃芪建中湯含藥血清聯(lián)合順鉑可以有效緩解肺癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，黃芪建中湯含藥血清聯(lián)合順鉑能夠抑制A549細(xì)胞株的增殖，增強(qiáng)人肺癌A549細(xì)胞株中E-cadherin蛋白、基因的表達(dá)，并降低人肺癌A549細(xì)胞株中Snail1蛋白、基因的表達(dá)。

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（收稿日期：2019-11-19? 本文編輯：任秀蘭）