隋明，李俊儒，張鳳英，吳霞，謝慧蓉，楊晨

(1.四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 都江堰 611830；2.加拿大阿爾伯塔大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，埃德蒙頓 加拿大 T6G2R3)

甘藍(lán)尤其是羽衣甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar. acephala f. tricolor)是一種口感香脆、營養(yǎng)豐富的蔬菜，其含有Fe、Ca和胡蘿卜素、VC等多種微量元素以及礦物質(zhì)[1]。此外，甘藍(lán)類蔬菜還含有比其他蔬菜更高含量的蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是可食用率高、纖維素含量豐富、食用范圍最廣的蔬菜之一[2]。將蔬菜做成泡菜不僅可以佐餐，還能夠減少因萎蔫、腐爛導(dǎo)致的浪費，而且有關(guān)研究人員發(fā)現(xiàn)泡菜還有一些特殊的功能如其可以逆轉(zhuǎn)脫發(fā)等[3]。但因泡菜的生產(chǎn)工藝及原材料等方面原因，制作具有較好香氣[4,5]和口感的健康泡菜取決于很多因素如：優(yōu)良的乳酸菌菌種、亞硝酸鹽含量的控制等[6,7]，尤其優(yōu)良的發(fā)酵菌種是至關(guān)重要的，其次是不同的發(fā)酵條件對泡菜產(chǎn)品的硝酸鹽、總酸、風(fēng)味化合物等物質(zhì)生成的影響成為目前泡菜研究中的主要課題[8]。泡菜發(fā)酵的基本原理是：首先，將乳酸菌加入到發(fā)酵陶壇中，再加入經(jīng)過前處理的蔬菜，使發(fā)酵蔬菜具有獨特的風(fēng)味和口感；其次，加入食鹽，均勻滲透到蔬菜內(nèi)部，使組織內(nèi)的水分被滲透壓調(diào)整，提高脆度和口感等；最后，通過發(fā)酵過程中的各種物理和化學(xué)過程，該反應(yīng)產(chǎn)生泡菜產(chǎn)品的獨特風(fēng)味、顏色和質(zhì)地。目前泡菜的生產(chǎn)與加工幾乎都是通過人工接種，可以將發(fā)酵基質(zhì)中的乳酸菌形成優(yōu)勢菌，避免雜菌的生長[9]。

本試驗通過以羽衣甘藍(lán)為泡菜的主要原料輔以其他佐料，通過接種乳酸菌考察了在自然發(fā)酵和接種發(fā)酵條件下亞硝酸鹽含量、pH、酸價的變化，以期通過對照，確定羽衣甘藍(lán)泡菜發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)。

1 試驗材料

1.1 試驗材料

甘藍(lán)：都江堰市售羽衣甘藍(lán)；純凈水：都江堰藍(lán)光純凈水廠；泡菜鹽(川晶泡菜鹽)：四川鹽業(yè)總公司；冰糖(千柏山牌單晶水塘)：云南綾悅軒食品有限公司；生姜(都江堰市售干姜)、胡椒粉(醇禾白胡椒粉)：泰州市永泰食品有限公司；冰乙酸：天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品：中科北京儀器耗材標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.2 接種泡菜發(fā)酵工藝

試驗的接種型泡菜甘藍(lán)制作流程圖見圖1。將羽衣甘藍(lán)洗凈、瀝水，切成2 cm×5 cm小長條，在烘箱中在40 ℃條件下烘干，烘干后放入已經(jīng)接入乳酸菌(植物乳桿菌/鼠李糖乳桿菌)的泡菜陶壇中，進(jìn)行泡菜發(fā)酵。

圖1 泡菜工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of pickle

2 試驗方法

將泡菜在自然發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵，并在30 ℃下采用接種乳酸菌的方式進(jìn)行發(fā)酵，兩者做對照比較相關(guān)指標(biāo)。分別考察發(fā)酵5 d、不同菌種比例、不同接種量、發(fā)酵溫度、蔗糖添加量和食鹽添加量對甘藍(lán)泡菜基質(zhì)中亞硝酸鹽含量、pH和酸價的影響。

2.1 亞硝酸鈉測定方法

參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》，使用離子色譜法進(jìn)行測定，取部分甘藍(lán)泡菜試樣經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后，采用相應(yīng)的方法提取和凈化，以KOH為淋洗液，陰離子交換柱分離，電導(dǎo)檢測器或紫外檢測器檢測，以保留時間定性，外標(biāo)法定量。

2.2 總酸含量測定方法

參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》，采集泡菜樣品不少于200 g，放置于組織攪碎機(jī)中，加入與樣品等量煮沸過的純凈水，用研缽搗碎，混合均勻后放置在潔凈的燒杯中，從中精確取出50.000 g樣品，用煮沸的水將燒杯中內(nèi)容物全部轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中，放置于沸水浴中煮沸，并搖動若干次，用快速濾紙過濾，收集濾液，用于測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 自然發(fā)酵與接種乳酸菌發(fā)酵的前期時間比較

在自然富集菌種和接種乳酸菌的甘藍(lán)泡菜發(fā)酵5 d后，測定亞硝酸鹽含量、pH值和總酸，結(jié)果見表1。

表1 天然發(fā)酵和接種發(fā)酵之間的指標(biāo)比較Table 1 Comparison of indexes between natural fermentation and inoculation fermentation

由表1可知，發(fā)酵5 d后人工接種發(fā)酵泡菜基質(zhì)中的亞硝酸鹽含量明顯低于自然發(fā)酵，pH值也低于自然發(fā)酵，總酸量小于自然發(fā)酵。亞硝酸鹽是一種致癌化學(xué)物質(zhì)，是發(fā)酵類型食品能否出廠的一個重要指標(biāo)，通過自然發(fā)酵獲得的泡菜產(chǎn)品具有高亞硝酸鹽含量。通過本小節(jié)試驗可以得出結(jié)論，為了保證泡菜產(chǎn)品的安全性，應(yīng)選擇人工接種發(fā)酵。賈慶超等模擬了自然發(fā)酵的條件下發(fā)酵不同類型蔬菜，通過考察不同發(fā)酵時間內(nèi)的亞硝酸鹽含量，確定其適合食用的時間和亞硝酸鹽變化規(guī)律[10]，其試驗結(jié)果表明不同類型的蔬菜在冷藏相同時間內(nèi)硝酸鹽含量是不同的，苤藍(lán)泡菜中亞硝酸鹽含量較低。而周強通過考察大白菜發(fā)酵過程中不同時間內(nèi)亞硝酸鹽含量，發(fā)現(xiàn)總酸、亞硝酸鹽含量均在發(fā)酵的第5天或第7天出現(xiàn)最高值[11]，該試驗結(jié)果同本試驗結(jié)果相同，說明發(fā)酵型泡菜在發(fā)酵5～7 d時不宜食用。

3.2 不同菌株配比對泡菜發(fā)酵的影響

分別向甘藍(lán)泡菜基質(zhì)中接入鼠李糖乳桿菌∶植物乳桿菌的比例，考察甘藍(lán)泡菜成品的顏色、香氣、味道和質(zhì)地的評分，確定接種菌株的比例。

表2 不同菌株的泡菜質(zhì)量綜合評分表Table 2 Comprehensives scoring table of pickle quality fermented by different strains

圖2 不同菌株的比例對泡菜質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of the proportions of different strains on the quality of pickle

由表2和圖2可知，在鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌的接種率為1∶0、1∶1、0∶1的情況下發(fā)酵泡菜，并對產(chǎn)品進(jìn)行感官評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接種率為1∶1時，泡菜的味道最好。當(dāng)兩種菌株混合接種時，發(fā)酵速度加快，乳酸菌產(chǎn)生乳酸的速度增加，pH值加快，泡菜產(chǎn)品香氣濃郁，口感好。苗鐘化[12]對比了泡菜直投菌同鼠李糖乳桿菌GG對因抗生素導(dǎo)致的小鼠腸胃紊亂的效果，發(fā)現(xiàn)兩種條件下制作的泡菜均有改善的效果。任大勇等[13]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌對辣白菜泡菜中風(fēng)味物質(zhì)的生成及菌群結(jié)構(gòu)有著明顯的影響，其能夠?qū)е戮湄S度降低，總酸含量在第5天達(dá)到最高，但總體上可以縮短發(fā)酵時間。而本試驗使用的兩種菌均為前人實驗得到較好的發(fā)酵效果，如李霜等[14]從市售泡菜中分離到一株可以降解亞硝酸鹽的植物乳桿菌SA-4(LactobacillusplantarumSA-4)，其采用該菌株發(fā)酵泡菜可以顯著降低泡菜基質(zhì)中的亞硝酸鹽。凌潔玉等[15]也通過實驗證實了植物乳桿菌具有降解亞硝酸鹽的作用，因此說明該屬菌株可以作為發(fā)酵泡菜的一種直投菌株。

3.3 接種量對泡菜接種和發(fā)酵的影響

在本小節(jié)試驗中采用鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌為1∶1的比例，在接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%的情況下，分別考察成品甘藍(lán)泡菜的顏色、香氣、味道、質(zhì)地情況，對其進(jìn)行評分(見表3)，同時以發(fā)酵泡菜基質(zhì)中的總酸和pH為指標(biāo)，測定了在不同接種量的情況下兩種指標(biāo)發(fā)生的變化。

表3 泡菜的不同接種量的綜合評分表Table 3 Comprehensive scoring table of pickle with different inoculum size

圖3 不同接種量對總酸和pH的影響Fig.3 Effect of different inoculum size on total acid and pH

由圖3可知，接種量對泡菜的質(zhì)量有很大影響。較小的接種量導(dǎo)致較長的發(fā)酵時間，造成發(fā)酵基質(zhì)出現(xiàn)較低總酸和較高pH的情況，影響產(chǎn)品生產(chǎn)率和發(fā)酵周期。當(dāng)接種量過大時，乳酸菌的生長速度過快，會增加產(chǎn)品乳酸，導(dǎo)致總酸過高，pH值過低，滋味較差，其他次生代謝廢物的產(chǎn)量也增加。在該試驗中，進(jìn)行了接種量為1%、2%、3%、4%和5%的泡菜產(chǎn)品的感官評價。綜合分析表明，當(dāng)接種量為3%時，發(fā)酵得到的泡菜質(zhì)量最好。

3.4 溫度對泡菜發(fā)酵的影響

在本小節(jié)試驗中采用鼠李糖乳桿菌∶植物乳桿菌為1∶1的比例，在接種量為3%的情況下，分別考察培養(yǎng)溫度為23，30，37 ℃時成品甘藍(lán)泡菜的顏色、香氣、味道、質(zhì)地情況，對其進(jìn)行評分，同時以發(fā)酵泡菜基質(zhì)中的總酸和pH為指標(biāo)，測定了在不同溫度情況下兩種指標(biāo)發(fā)生的變化。

表4 不同溫度影響泡菜指標(biāo)的綜合評分表Table 4 Comprehensive scoring table of pickle indexes affected by different temperatures

由表4可知，泡菜的口感隨著溫度的升高而逐漸增加，并且在約30 ℃時獲得最佳口感，當(dāng)采用37 ℃發(fā)酵時品質(zhì)會降低，說明溫度是影響泡菜發(fā)酵的因素之一。這可能是因為當(dāng)溫度太低時，乳酸菌的生長速度變慢，泡菜的發(fā)酵周期大大增加，同時發(fā)酵的泡菜味道不好，質(zhì)地柔軟。當(dāng)溫度太高時，乳酸菌的生理活性受到抑制，泡菜顏色被發(fā)酵，甚至?xí)泻肿儼l(fā)生。在本小節(jié)試驗中，在23，30，37 ℃的溫度下對泡菜產(chǎn)品進(jìn)行感官評價后，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度控制在約30 ℃時，泡菜的風(fēng)味良好并且沒有發(fā)生褐變。熊濤[16]在不同溫度下以圓白菜為原料考察了發(fā)酵過程中發(fā)酵基質(zhì)的pH、微生物等的變化，結(jié)果表明溫度越高，發(fā)酵基質(zhì)的pH越低，而當(dāng)使用較低的培養(yǎng)溫度發(fā)酵時，發(fā)酵的周期也變長。

3.5 蔗糖添加是泡菜發(fā)酵的影響

在本小節(jié)試驗中采用鼠李糖乳桿菌∶植物乳桿菌為1∶1的比例，在接種量為3%，發(fā)酵溫度為30 ℃的情況下，分別考察蔗糖添加量為0%、1%、2%、3%、4%時成品甘藍(lán)泡菜的顏色、香氣、味道、質(zhì)地情況，對其進(jìn)行評分(見表5)，同時以發(fā)酵泡菜基質(zhì)中的總酸和pH為指標(biāo)，測定了在不同溫度的情況下兩種指標(biāo)發(fā)生的變化。

表5 不同加糖量泡菜質(zhì)量的綜合評分表Table 5 Comprehensive scoring table of pickle quality with different sugar additive amount

圖4 不同蔗糖添加量對總酸和pH的影響Fig.4 Effect of different sucrose additive amount on total acids and pH

由圖4可知，總酸含量隨著蔗糖含量的增加而增加，pH值隨著蔗糖含量的增加而降低。當(dāng)蔗糖含量增加時，乳酸菌發(fā)酵的乳酸含量也增加，因此pH值降低并且總酸含量增加。當(dāng)加入的糖量為2%時，顏色鮮艷，味道更好，存在典型的泡菜風(fēng)味，并且氣味強烈。如果不添加蔗糖，則發(fā)酵的泡菜產(chǎn)品不具有良好的口感，并且香氣不濃，pH太高且總酸太低。加入蔗糖后，泡菜的質(zhì)量不會受到影響，但當(dāng)蔗糖含量過高時，過多的糖會降低泡菜的酸度，同時增加成本，此時pH較低，味道極佳。因此，根據(jù)感官、總酸和pH值的結(jié)果分析后得出結(jié)論，當(dāng)加入的蔗糖量為2%時產(chǎn)品最佳。

燕平梅等[17]通過實驗研究了蔗糖對發(fā)酵蔬菜品質(zhì)的影響，其發(fā)現(xiàn)在2%濃度下制作的泡菜產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量最低，乳酸菌的含量最高，該實驗結(jié)果同本小節(jié)試驗的結(jié)果相同，可以推測在一定條件下，添加2%的蔗糖有利于減少泡菜中的亞硝酸鹽含量，同時還能夠提高蔬菜的脆度和口感以及翠綠的外觀顏色。侯方麗等[18]也使用甘藍(lán)作為主要原料考察了不同因素對甘藍(lán)泡菜品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)蔗糖添加量為2%時，發(fā)酵6 d后亞硝酸鹽含量降低到符合國家標(biāo)準(zhǔn)水平，該結(jié)果同本試驗的研究結(jié)果相同。

3.6 鹽添加量對泡菜發(fā)酵的影響

在本小節(jié)試驗中采用鼠李糖乳桿菌∶植物乳桿菌為1∶1的比例，在接種量為3%、發(fā)酵溫度30 ℃的情況下，分別考察在食鹽添加量為2%、3%、4%、5%、6%的情況下對成品甘藍(lán)泡菜的顏色、香氣、味道、質(zhì)地情況，對其進(jìn)行評分(見表6)，同時以發(fā)酵泡菜基質(zhì)中的總酸和pH為指標(biāo)，測定了在不同食鹽添加量的情況下兩種指標(biāo)發(fā)生的變化。

圖5 不同鹽添加量對總酸和pH的影響Fig.5 Effect of different salt additive amount on total acids and pH

在本小節(jié)試驗中，當(dāng)泡菜鹽的添加量為2%、3%、4%、5%、6%時，通過綜合評分評價泡菜產(chǎn)品，并測定總酸和pH。由圖5可知，隨著鹽濃度增加，pH值增加，總酸減少。當(dāng)鹽濃度為2%時，pH值太低，總酸含量高，成品泡菜的味道太酸，但加入不同食鹽含量發(fā)酵的泡菜在感官上差別不大。當(dāng)鹽含量為3%時，泡菜味道最好，味道鮮脆，香氣濃郁，質(zhì)地不柔軟，但在此鹽濃度下，pH值也低，總酸度過高，不利于泡菜的貯藏，保鮮期短，容易腐敗，從保質(zhì)期和貨架期方面來看，應(yīng)選擇較高的鹽濃度，如4%。但當(dāng)鹽的濃度太高時，味道過咸，顏色不新鮮，呈現(xiàn)黑黃的狀態(tài)，并且隨著鹽濃度增加，pH降低的速率將變慢。此外，鹽濃度過高不利于身體健康。因此，鹽的最佳加入量為4%。

表6 不同加鹽量泡菜質(zhì)量的綜合評分表Table 6 Comprehensive scoring table of pickle quality with different salt additive amount

王向陽等[19]以蘿卜為主要原料研究了腌制條件對加工工藝和保質(zhì)期的影響，結(jié)果表明：在4%的食鹽添加量時，適合乳酸菌的生長及生成適量的乳酸，而且還能減少引起生花等腐敗菌的繁殖，其也驗證了在泡菜基質(zhì)中接種植物乳桿菌可以將發(fā)酵時間控制在適當(dāng)?shù)姆秶?，而且成品的腌蘿卜泡菜口感和風(fēng)味最好。李軍波[20]通過多項指標(biāo)考察了食鹽濃度對發(fā)酵型泡菜的影響，發(fā)現(xiàn)在2%的食鹽添加量時，泡菜中的乳酸菌菌體數(shù)量最高，但是發(fā)酵泡菜基質(zhì)中的pH很低；而5%食鹽添加量可以較好地抑制其他腐敗菌的繁殖。該試驗結(jié)果同本小節(jié)試驗得出的采用4%的食鹽添加量的結(jié)論相似。付莎莉等通過試驗研究了不同食鹽濃度對白菜、豇豆、蘿卜3種不同蔬菜發(fā)酵制備泡菜的影響，結(jié)果表明：在食鹽添加量為6%時，革蘭氏陽性菌占據(jù)主要菌群優(yōu)勢，其中植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是發(fā)酵中的有益菌。該結(jié)果與本小節(jié)試驗結(jié)論比較接近，在以蔬菜為發(fā)酵原料時，食鹽的最佳添加量約為4%～6%，而且為了保證發(fā)酵泡菜能夠含有較低的雜菌數(shù)量，在此范圍內(nèi)適合植物乳桿菌生長。

3.7 接種量對泡菜亞硝酸鹽含量的影響

在1∶1比例接種量的條件下對泡菜基質(zhì)亞硝酸鹽含量的影響見圖6。不同的接種水平對泡菜的亞硝酸鹽含量有一定的影響。隨著接種量的增加，亞硝酸鹽含量降低。原因可能是接種乳酸菌后會產(chǎn)生大量的乳酸，這會使亞硝酸鹽還原為無毒物質(zhì)，也可能是因為接種了大量的乳酸菌，抑制了其他細(xì)菌的生長，并減少了硝酸鹽還原成亞硝酸鹽的量。但當(dāng)接種量過大時，泡菜的味道會變酸，綜合考慮，當(dāng)接種量為3%時，亞硝酸鹽含量低，口感最佳。

圖6 不同接種量對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響Fig.6 Effect of different inoculum size on nitrite content in pickle

3.8 溫度對泡菜亞硝酸鹽含量的影響

溫度對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響不是很大，但是當(dāng)溫度高時，乳酸菌的生長受到抑制，并且大大降低了亞硝酸鹽的還原能力，導(dǎo)致亞硝酸含量增加。當(dāng)溫度低時，乳酸菌的活性將受到一定程度的抑制。只有當(dāng)乳酸菌處于最佳溫度時，才適合發(fā)酵泡菜，試驗結(jié)果見表7。綜合考慮，采用30 ℃的發(fā)酵溫度制作甘藍(lán)泡菜較為適合。

表7 溫度對泡菜亞硝酸鹽含量的影響Table 7 Effect of temperature on nitrite content in pickle

3.9 不同菌株對泡菜亞硝酸鹽含量的影響

對泡菜的制作影響因素最大的是微生物的作用，本試驗采用接種不同比例的鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵甘藍(lán)泡菜的試驗，試驗結(jié)果見表8。

表8 不同菌株對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響Table 8 Effect of different strains on nitrite content in pickle

當(dāng)采用鼠李糖乳桿菌單獨接種時，泡菜的亞硝酸鹽含量較低，此時泡菜的味道不太好；當(dāng)單獨接種植物乳桿菌時，泡菜的味道變得更好，但亞硝酸鹽含量更高；當(dāng)兩種菌株組合使用時，泡菜的亞硝酸鹽含量較低，而且還具有良好的口感，因此采用1∶1的比例接種于甘藍(lán)泡菜進(jìn)行發(fā)酵結(jié)果最好。

李春等[21]證實鼠李糖乳桿菌在一定條件下可以降解亞硝酸鹽，該試驗結(jié)果同本試驗結(jié)果一致，而且鼠李糖乳桿菌可以抑制黃曲霉等產(chǎn)毒真菌，具有較強的抑制作用[22]。植物乳桿菌具有較強的降解亞硝酸鹽的作用[23]，楊晶等[24]還通過實驗證實其降解亞硝酸鹽與其產(chǎn)酸能力有關(guān)，其中蘋果酸和乳酸的效果最明顯。

4 結(jié)論

通過單因素試驗確定了接種乳酸菌發(fā)酵甘藍(lán)泡菜的最佳工藝條件：4%食鹽，3%乳酸菌接種量(30 ℃發(fā)酵溫度，2%蔗糖，植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌比例為1∶1)。采用人工接種和發(fā)酵的泡菜具有更好的味道，并且亞硝酸鹽含量遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)的20 mg/kg泡菜產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。而且接種發(fā)酵比自然發(fā)酵時間短，可以實現(xiàn)批量化生產(chǎn)，所得產(chǎn)品具有相似的稠度，遠(yuǎn)優(yōu)于自然發(fā)酵的泡菜口感和質(zhì)量。