張雪曉，李陽(yáng)杰，崔曉鴿，鄭巖

(1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，鄭州 450064；2.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，鄭州 451150；3.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 201203)

高強(qiáng)度磁場(chǎng)技術(shù)不斷發(fā)展和傅里葉變換的應(yīng)用，為磁共振技術(shù)應(yīng)用于定量分析領(lǐng)域奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[1]。近年來《中華人民共和國(guó)藥典》 《英國(guó)藥典》《美國(guó)藥典》《日本藥局方》及《歐洲藥典》等均收載了定量核磁技術(shù)。磁共振定量法(quantitative nuclear magnetic resonance，qNMR)應(yīng)用最為廣泛的是氫磁共振定量法(quantitative proton nuclear magnetic resona-nce，qHNMR)，其定量準(zhǔn)確度可以接近高效液相色譜(HPLC)法水平[2-6]。含量測(cè)定大多采用內(nèi)標(biāo)法，即以結(jié)構(gòu)和含量已知的化合物作為內(nèi)標(biāo)，與待分析成分配制成混合溶液進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，通過比較兩者的積分面積確定待測(cè)成分的含量[6-8]。

地氯雷他定(desloratadine)化學(xué)名為8-氯-6，11-二氫-11-(4-哌啶烯基)-5H-苯并[5，6]環(huán)庚基[1，2-b]吡啶。地氯雷他定片主要用于緩解慢性特發(fā)性蕁麻疹及常年性變應(yīng)性鼻炎的全身及局部癥狀[9]。雖然國(guó)家藥典委員會(huì)于2012年修訂地氯雷他定片[標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為WS1-(X-401)-2004Z]的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，但2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》仍未收錄該品種。修訂版標(biāo)準(zhǔn)中地氯雷他定片的含量測(cè)定采用HPLC法，需要對(duì)其雜質(zhì)進(jìn)行分離，且引入校正因子后才能得出含量。鑒別采用HPLC法和紫外-可見分光光度法，操作過程較為繁瑣，且各類試劑消耗量大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因而建立一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的含量測(cè)定方法及鑒別方法顯得意義重大。qNMR法是一種含量測(cè)定和鑒別、鑒定同時(shí)進(jìn)行的分析方法，近年來越來越多地應(yīng)用于藥物分析領(lǐng)域。本研究采用1H-NMR法對(duì)地氯雷他定片進(jìn)行鑒別、鑒定，qHNMR法測(cè)定地氯雷他定含量，為地氯雷他定片質(zhì)量控制提供新的分析方法，也為qHNMR法進(jìn)一步推廣提供有價(jià)值的經(jīng)驗(yàn)[5-6]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 400 MHz磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司，型號(hào)：AvanceIII型)；高效液相色譜儀(安捷倫公司，型號(hào)：1200型，包括四元高壓液相泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測(cè)器)；電子分析天平(METTLER TOLEDO精密儀器有限公司，型號(hào)：AB265-S型，感量：0.01 mg)。

1.2試藥 地氯雷他定片(上海先靈葆雅制藥有限公司，批號(hào)：20170201，20170204和20170205)；地氯雷他定對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量：99.6%，批號(hào)：100919-201402)；氘代三氯甲烷(CDCl3，美國(guó)Sigma公司)；1，2，4，5-四氯苯(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：34379)；磷酸二氫鉀(國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20161105)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1測(cè)試條件 qHNMR法：采用zg30脈沖序列，測(cè)定溫度為26.85 ℃，譜寬(SWH)為8012 Hz，采樣時(shí)間(AQ)為4.01 s，弛豫時(shí)間(D1)為15 s，脈沖寬度(P1)9.54 s，樣品掃描次數(shù)(NS)48次，空掃次數(shù)為2次。HPLC法：色譜柱為Agilent EXTEND RDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)為242 nm；流動(dòng)相為甲醇-10 mmol·L-1磷酸二氫鉀(45：55)；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為20 μL。

2.2內(nèi)標(biāo)、對(duì)照品與供試品溶液配制

2.2.1內(nèi)標(biāo)溶液與對(duì)照品溶液的配制 精密稱取1，2，4，5-四氯苯100.0 mg于50 mL量瓶中，加入CDCl3，加熱溶解后混勻，得濃度為2.0 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液，密封后于冰箱保存。精密稱取地氯雷他定對(duì)照品12.00 mg置于10 mL量瓶中，加入CDCl3，加熱溶解后混勻，得濃度為1.2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，密封后置于冰箱保存。

2.2.2供試品溶液的配制 取地氯雷他定片15片，于研缽中研細(xì)。以地氯雷他定計(jì)，精密稱取約10 mg，采用內(nèi)標(biāo)溶液定容至5 mL。取0.5 mL轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管中，待測(cè)。

2.31H-NMR鑒別 取片劑研磨后粉末適量，加入CDCl3后超聲，測(cè)試1H-NMR(400MHz，CDCl3)。測(cè)試結(jié)果如下δ：8.33～8.44(m，1H)，7.41～7.48(d，1H)，7.13～7.30(t，3H)，7.01～7.22(t，1H)，3.31～3.64(t，2H)，3.01～3.15(m，2H)，2.76～2.91(m，2H)，2.61～2.35(m，3H)，2.35～2.51(m，1H)，1.40～1.91(br，1H)。1H-NMR譜的芳香區(qū)(δ7.22～7.44)顯示了地氯雷他定結(jié)構(gòu)中6個(gè)芳香氫信號(hào)。高場(chǎng)區(qū)(δ2.35～3.64)共顯示12個(gè)質(zhì)子峰，對(duì)應(yīng)于結(jié)構(gòu)中6個(gè)亞甲基(部分質(zhì)子信號(hào)發(fā)生重疊)；δ：1.40～1.91為地氯雷他定結(jié)構(gòu)式中-NH質(zhì)子峰。綜上所述，1H-NMR圖譜與地氯雷他定分子式(C19H19ClN2)相符。

2.4qHNMR法測(cè)定地氯雷他定片含量

2.4.1專屬性考察 取“2.2.2”項(xiàng)下配制的地氯雷他定與1，2，4，5-四氯苯混合溶液，獲取1H-NMR，調(diào)整相位及基線后以CDCl3溶劑峰進(jìn)行定標(biāo) 。結(jié)果，1，2，4，5-四氯苯內(nèi)標(biāo)峰δ7.59與地氯雷他定的定量峰δ7.41～7.48完全分離，互不干擾。與未加內(nèi)標(biāo)的地氯雷他定1H-NMR相比較，加內(nèi)標(biāo)后1H-NMR譜中地氯雷他定各質(zhì)子峰化學(xué)位移均未發(fā)生變化，表明內(nèi)標(biāo)物質(zhì)1，2，4，5-四氯苯與地氯雷他定兩者可穩(wěn)定存在。

2.4.2方法學(xué)驗(yàn)證 qHNMR法測(cè)定藥物含量時(shí)定量峰和內(nèi)標(biāo)峰積分范圍的確定至關(guān)重要。選擇目標(biāo)峰進(jìn)行積分時(shí)，應(yīng)將峰譜圖放大，且選取峰形輪廓線與水平基線重合處為其起止點(diǎn)，在此積分原則情況下進(jìn)而進(jìn)行方法學(xué)研究。

參考“2.2.1”項(xiàng)下配制方法，采用內(nèi)標(biāo)溶液配制質(zhì)量濃度為1.84，3.69，6.08，9.37和11.86 mg·mL-1地氯雷他定一系列對(duì)照品溶液，轉(zhuǎn)移0.5 mL至核磁管中，進(jìn)樣測(cè)定、獲取各濃度的1H-NMR譜。地氯雷他定各濃度的1H-NMR譜調(diào)整相位及基線后，以地氯雷他定定量峰與內(nèi)標(biāo)峰峰面積之比為橫坐標(biāo)(X)，兩者質(zhì)量濃度比為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=2.214 6X+0.100 8(r=0.999 3)。表明地氯雷他定在1.84～11.86 mg·mL-1的范圍內(nèi)，地氯雷他定定量峰峰面積與對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，連續(xù)測(cè)定6次，以定量峰與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為參考(AS/Ar)，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果顯示RSD值為0.83%。取供試品溶液，分別于0，1，2，3，5 h進(jìn)樣測(cè)定。以定量峰與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為參考(AS/Ar)，計(jì)算RSD值為1.42%，表明樣品溶液在測(cè)試環(huán)境5 h內(nèi)穩(wěn)定。取地氯雷他定對(duì)照品溶液，逐步稀釋。以信噪比(S/N)為10時(shí)，作為定量下限(LOQ)。以S/N值為3時(shí)，作為檢出限(LOD)[8-9]。結(jié)果表明，LOQ為249.0 ng·mL-1，LOD為60.8 ng·mL-1。于地氯雷他定供試品溶液中分別加入低、中、高濃度地氯雷他定對(duì)照品，平行配制3份。按照“2.1”項(xiàng)下qHNMR方法進(jìn)行測(cè)試并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。低、中、高濃度回收率98.80%～100.82%，平均回收率分別為101.61%，100.29%，99.75%，RSD分別為2.10%，1.52%，0.76%(n=3)。

表1 地氯雷他定的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3質(zhì)量平衡法與氫磁共振法測(cè)定結(jié)果 qNMR法計(jì)算公式為：Wu=WsAuEu/AsEs。式中：Wu為地氯雷他定質(zhì)量(mg)；Au為地氯雷他定定量峰面積；As為內(nèi)標(biāo)峰面積；Ws為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量(mg)；Eu為地氯雷他定質(zhì)子當(dāng)量(地氯雷他定相對(duì)分子質(zhì)量與定量峰代表的質(zhì)子數(shù)之比)；Es為內(nèi)標(biāo)質(zhì)子當(dāng)量(內(nèi)標(biāo)相對(duì)分子質(zhì)量與內(nèi)標(biāo)峰代表的質(zhì)子數(shù)之比)。

取3批地氯雷他定片劑，分別采用HPLC法和qHNMR法測(cè)定地氯雷他定片中地氯雷他定的含量，結(jié)果見表2。可見HPLC法與qHNMR法測(cè)定結(jié)果基本一致。

表2 2種方法測(cè)定地氯雷他定片中地氯雷他定的含量比較

Tab.2Comparisonofdesloratadinecontentindicloratadinetabletsbytwomethods

mg/片

3 討論

qHNMR法用于測(cè)定藥物含量時(shí)，弛豫時(shí)間，采樣次數(shù)等儀器參數(shù)對(duì)含量測(cè)定結(jié)果也有一定影響[3-6]。采集時(shí)間與圖譜的分辨率有較大關(guān)系，若采集時(shí)間小于信號(hào)完全衰減成噪音時(shí)間，由于截尾效應(yīng)會(huì)把假信號(hào)帶入qHNMR圖譜，從而導(dǎo)致圖譜產(chǎn)生畸變。若采集時(shí)間大于信號(hào)完全衰減成噪音時(shí)間，則會(huì)增加測(cè)試時(shí)間。經(jīng)考察，最終選用采集時(shí)間為4.01 s。弛豫時(shí)間和采樣次數(shù)的確定是以定量峰和內(nèi)標(biāo)峰比值(Ax/As)趨于穩(wěn)定時(shí)的初始值為參考，可以保證采用較短測(cè)試時(shí)間的情況下，提高qHNMR法準(zhǔn)確性。分子結(jié)構(gòu)中甲基、亞甲基、次甲基、芳香氫等質(zhì)子的弛豫機(jī)制的不同，因而氫質(zhì)子恢復(fù)Boltzmann 平衡程度不同。所以定量峰和內(nèi)標(biāo)峰應(yīng)選擇同一類型氫質(zhì)子，提高qHNMR積分結(jié)果的一致性及準(zhǔn)確性，本研究采用的定量峰和內(nèi)標(biāo)峰均為芳香質(zhì)子。

采用qHNMR法測(cè)定藥物含量時(shí)，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)對(duì)qHNMR分析測(cè)試的準(zhǔn)確性也有很大影響[3-5，10]。前期對(duì)馬來酸、1，2，4，5-四氯苯、富馬酸二甲酯、對(duì)苯二甲酸二甲酯，苯甲酸卞酯等進(jìn)行了考察。發(fā)現(xiàn)馬來酸和1，2，4，5-四氯苯與地氯雷他定質(zhì)子峰可完全分離。但地氯雷他定結(jié)構(gòu)式中含2個(gè)N原子，呈一定的堿性；而馬來酸結(jié)構(gòu)式含2個(gè)-COOH，呈一定的酸性，為保證所選內(nèi)標(biāo)物質(zhì)不與地氯雷他定發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而影響qHNMR測(cè)定結(jié)果，最終選用1，2，4，5-四氯苯作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，并進(jìn)行一系列方法學(xué)驗(yàn)證。地氯雷他定含量測(cè)定結(jié)果顯示，qHNMR法與HPLC法測(cè)定結(jié)果較為接近，但qHNMR法具有快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，且可實(shí)現(xiàn)定性鑒別、鑒定和含量測(cè)定同步進(jìn)行，為應(yīng)用于藥物的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)，有助于qHNMR法將來在藥學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。