任玉玲 張曉帆 孔蕾 唐仲書 張利偉

青光眼是以進(jìn)行性眼部視神經(jīng)病變，及伴隨的不可逆性視功能喪失為特征的一類疾病，發(fā)病機(jī)制目前尚未明確[1]。2010年，Thorleifsson等[2]研究發(fā)現(xiàn)了窖蛋白(Caveolin，Cav)-1/2與原發(fā)性開角型青光眼可能有聯(lián)系，但Cav-1/2位點(diǎn)與原發(fā)性開角型青光眼如何相關(guān)尚未完全清楚。目前，Cav-1對青光眼的作用研究主要集中在其對房水引流通道及房水動(dòng)力學(xué)的影響上[3-6]。那么，Cav-1是否只通過這一途徑影響青光眼的病理生理過程？研究發(fā)現(xiàn)，Cav-1廣泛分布于視網(wǎng)膜血管細(xì)胞[7]、Müller細(xì)胞[8]、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)[9]以及光感受器細(xì)胞[10]。結(jié)合Cav-1在視網(wǎng)膜中的表達(dá)分布及功能，我們認(rèn)為，Cav-1可能參與了青光眼中視網(wǎng)膜損傷的病理過程。為驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，本研究擬建立急性高眼壓(acute ocular hypertension,AOH)小鼠模型，通過不同方法檢測Cav-1 的表達(dá)變化，初步明確Cav-1是否參與AOH視網(wǎng)膜損傷的病理過程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選擇6～8周齡的C57野生型雌性小鼠75只，體質(zhì)量18～22 g，實(shí)驗(yàn)前檢查雙眼前節(jié)和眼底均正常。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由中山大學(xué)中山眼科中心動(dòng)物科提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)使用條件均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。小鼠隨機(jī)分為兩組：實(shí)驗(yàn)組60只，通過前房灌注法建立AOH模型；對照組15只，不做任何處理。

1.2 主要試劑及儀器抗Cav-1抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；抗GAPDH抗體、辣根過氧化物酶羊抗兔抗體、多聚甲醛(美國Sigma公司)；羊抗兔熒光二抗、驢血清(美國Millipore)；TRIzol(美國Life); PrimeScript RT reagent Kit(日本TAKARA)；SYBR?Green Master Mix(美國Roche)。蛋白電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad)；激光共焦顯微鏡LSM710(德國Zeiss公司)。

1.3 動(dòng)物模型建立及標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組小鼠隨機(jī)選取一眼建立AOH模型。具體方法為：小鼠腹腔內(nèi)注射43 g·L-1水合氯醛(0.01 mL·g-1)全身麻醉，使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液散大瞳孔；將連接生理鹽水瓶的30 G針頭插入術(shù)眼前房，緩慢調(diào)節(jié)生理鹽水瓶高度至150 cm，使眼壓約110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg),此時(shí)可見角鞏膜緣血管蒼白，視網(wǎng)膜血管蒼白，表示視網(wǎng)膜缺血成功；持續(xù)60 min后，拔出前房灌注針頭，恢復(fù)視網(wǎng)膜血供,此時(shí)可見角鞏膜緣血管恢復(fù)血供，視網(wǎng)膜血管恢復(fù)血供，表示再灌注成功[11]。對側(cè)眼不做任何處理。

1.4 熒光定量PCR(Q-PCR)檢測小鼠過量麻醉處死，收取對照組及AOH模型建立后1 d、2 d、3 d、7 d實(shí)驗(yàn)組小鼠眼球，各5只小鼠5眼，置于冰上迅速分離出視網(wǎng)膜。使用TRNzol試劑抽提總RNA,分離純化后使用紫外分光光度計(jì)法定量。行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，以其為模板進(jìn)行Q-PCR檢測。反應(yīng)條件詳見文獻(xiàn)[11]。檢測Cav-1 mRNA表達(dá)變化，引物序列為：β-actin上游引物為5’-GGCACCAGGGCGTGATGG-3’，下游引物為3’-GTCTCAAACATGATCTGGGTC-5’； Cav-1上游引物為5’-TGGAGTCACAGAAGGAGTGGCT-3’，下游引物為3’-GACCACAGTGAGGAATGTCCAC-5’。

1.5 Western blot檢測小鼠過量麻醉處死，收取對照組及AOH模型建立后1 d、2 d、3 d、7 d實(shí)驗(yàn)組小鼠眼球，各5只小鼠5眼，置于冰上迅速分離出視網(wǎng)膜。蛋白裂解液抽提蛋白，等量蛋白常規(guī)上樣、跑膠、轉(zhuǎn)膜后，加入11000兔抗小鼠Cav-1抗體，4 ℃冰箱內(nèi)過夜孵育。洗膜后，加入15000辣根過氧化物酶羊抗兔抗體室溫下孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯色，以GAPDH作為內(nèi)參，比較各組間Cav-1蛋白表達(dá)差異。

1.6 免疫熒光檢測小鼠過量麻醉處死，收取對照組及AOH模型建立后1 d、2 d、3 d、7 d實(shí)驗(yàn)組小鼠眼球，各5只小鼠5眼行冰凍切片。將切好的眼球冰凍切片從-20 ℃冰箱中取出，室溫下自然風(fēng)干1 h以上，浸入1 g·L-1TritonX-100中室溫處理10 min。PBS漂洗后用體積分?jǐn)?shù)5%驢血清室溫封閉1 h，小鼠來源Cav-1抗體(1200)4 ℃孵育2 h。取出標(biāo)本，PBS漂洗后驢抗小鼠熒光二抗(11000)常溫下孵育1 h。PBS漂洗后封片，于免疫熒光顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用Graph Pad軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Q-PCR檢測結(jié)果與對照組比較，Cav-1 mRNA在實(shí)驗(yàn)組小鼠造模后1 d的視網(wǎng)膜中即有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且這一升高趨勢在造模后2 d達(dá)到高峰，與造模后1 d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨后Cav-1 mRNA表達(dá)下降，但在造模后7 d時(shí)與對照組比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠視網(wǎng)膜Cav-1 mRNA表達(dá) 與對照組相比，*P<0.05

2.2 Western blot檢測結(jié)果Western blot檢測結(jié)果顯示，Cav-1蛋白在對照組視網(wǎng)膜中表達(dá)較低。造模后1 d，實(shí)驗(yàn)組小鼠視網(wǎng)膜Cav-1蛋白表達(dá)即開始升高，但與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.194)；之后Cav-1蛋白表達(dá)逐漸升高，于造模后3 d 達(dá)到高峰；造模后7 d Cav-1蛋白表達(dá)有所降低。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組造模后2 d、3 d及7 d Cav-1蛋白表達(dá)均較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025、0.012、0.035)。見圖2。

圖2 Western blot檢測各組小鼠視網(wǎng)膜Cav-1蛋白表達(dá) 與對照組相比，*P<0.05

2.3 免疫熒光檢測結(jié)果免疫熒光檢測結(jié)果顯示，對照組Cav-1表達(dá)主要分布在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、外叢狀層及脈絡(luò)膜血管層。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組造模后1 d即可見視網(wǎng)膜中Cav-1熒光高表達(dá)，并且高表達(dá)一直持續(xù)，在造模后2 d、3 d及7 d均可檢測到高熒光表達(dá)(圖3)。

圖3 免疫熒光檢測各組小鼠視網(wǎng)膜Cav-1表達(dá)

3 討論

Cav是細(xì)胞脂膜的內(nèi)陷囊狀結(jié)構(gòu)，典型大小為50～100 nm,其在脂質(zhì)交換、轉(zhuǎn)胞吞、細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)、機(jī)械力傳導(dǎo)以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中均發(fā)揮了重要作用。Cav-1是Cav特異性的結(jié)構(gòu)蛋白，是構(gòu)成Cav最重要的結(jié)構(gòu)成分。Cav-1在不同疾病模型中的作用不同，其表達(dá)呈損傷和組織特異性。當(dāng)大腦皮層冷損傷引起血-腦屏障破壞后，可見損傷部位Cav-1表達(dá)增加[12]；而在大腦缺血-再灌注損傷誘導(dǎo)下，損傷部位Cav-1表達(dá)呈早期下降、晚期升高變化[13]；這些研究表明，在相同的組織，不同的損傷機(jī)制可誘導(dǎo)不同的Cav-1表達(dá)變化。在心肌缺血-再灌注損傷后，損傷部位Cav-1表達(dá)降低[14]；而在肝臟缺血-再灌注損傷中，Cav-1呈時(shí)間依賴性表達(dá)升高[15]；這些研究表明，相同的損傷機(jī)制，在不同組織中Cav-1 的表達(dá)變化也可能不同。

自從2010年發(fā)現(xiàn)Cav-1/2基因多態(tài)性與原發(fā)性開角型青光眼有關(guān)聯(lián)后，越來越多的研究者開始探索Cav-1在青光眼中的作用。 有研究發(fā)現(xiàn)，在Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞和小梁網(wǎng)中富含Cav[16-17]。Clark等[18]研究表明，小梁網(wǎng)細(xì)胞使用地塞米松或可溶性CD44可分別誘導(dǎo)Cav-1的表達(dá)或磷酸化，這提示Cav-1可能參與了激素性青光眼的發(fā)病過程。最近，Aga等[19]在體外培養(yǎng)的眼前節(jié)組織塊及小梁網(wǎng)細(xì)胞中暫時(shí)性沉默Cav-1和Cav-2，發(fā)現(xiàn)沉默Cav-1增加了房水流出率，而沉默Cav-2減少了房水流出率。該作者在沉默Cav-1或Cav-2的小梁網(wǎng)細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了基質(zhì)增加的完全逆轉(zhuǎn)。最近的研究結(jié)果提示，Cav缺失會(huì)使傳統(tǒng)房水流出通道更易受眼壓變化的損傷，而且，Cav-1缺失引起的一氧化氮合成酶高活性會(huì)導(dǎo)致房水流出通道蛋白的硝酸化[20]。這些結(jié)果提示，Cav-1在維持眼壓，尤其是在調(diào)節(jié)房水流出中發(fā)揮了重要作用。

Cav-1是否只通過房水流出通道參與青光眼的病理過程？在成年小鼠視網(wǎng)膜，Cav-1是主要的可檢測到的Cav蛋白家族成員，其高表達(dá)于視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜血管和Müler細(xì)胞，低表達(dá)于RPE[1]。Cav-1以及形態(tài)可辨的Cav在視網(wǎng)膜的表達(dá)及分布提示其在視網(wǎng)膜功能中的重要作用。在Cav-1基因敲除小鼠中，研究者發(fā)現(xiàn)，暗適應(yīng)視網(wǎng)膜電流圖的a波及b波均受到了顯著影響。通過使用增強(qiáng)磁共振進(jìn)行體內(nèi)功能測試，Li等[21]發(fā)現(xiàn)，Cav-1基因敲除小鼠暗適應(yīng)下離子攝取被顯著抑制，這提示光感受器暗電流的減少。這些研究均提示，光感受器內(nèi)的Cav-1對光感受器功能的維持很重要。Cav-1的重要性在于維持視網(wǎng)膜的微環(huán)境，從而保持神經(jīng)功能。其可能的原因是，Cav-1缺失改變了光感受器周圍的離子環(huán)境。本研究中通過Q-PCR、Western blot以及免疫熒光檢測等方法均發(fā)現(xiàn)，Cav-1在AOH模型中表達(dá)隨再灌注時(shí)間的延長而逐漸升高，達(dá)到高峰后逐漸降低。這一發(fā)現(xiàn)表明，Cav-1參與了AOH的病理過程，但在其中的作用目前還不清楚。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，AOH模型中有Cav-1表達(dá)的明顯變化，其結(jié)果初步提示Cav-1參與了AOH的病理過程。但Cav-1在AOH模型中表達(dá)升高的意義是什么，其參與AOH病理過程的機(jī)制是什么，對AOH病理過程是損傷還是保護(hù)作用等問題均有待進(jìn)一步研究。