吳杰儒

(江西省婦幼保健院檢驗科，南昌 330006)

復發(fā)性流產(RSA)是指存在≥3次持續(xù)性自然流產現(xiàn)象，其病因與胚胎染色體異常、生殖道解剖異常、內分泌異常等因素有關，但有40%～50%的患者流產原因不明確，稱為不明原因反復流產(URSA)[1]。有研究[2]發(fā)現(xiàn)，母體的妊娠免疫耐受失衡與URSA發(fā)生有關，而妊娠免疫耐受失衡常伴隨著T細胞的異常增殖活化和細胞因子的異常分泌。程序性細胞死亡分子-1(PD-1)作為重要的抑制性共刺激分子，通過抑制T細胞的活化和增殖負性調控免疫應答。鑒于此，本研究探討URSA患者T細胞中PD-1的表達及其臨床意義，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年5月至2019年5月江西省婦幼保健院收治的URSA患者20例(URSA組)，選擇同期行人工流產的正常健康早孕婦女20例作為對照組。URSA組，年齡22～35歲，平均(28.67±3.16)歲；孕周5～12周，平均(8.75±2.13)周。對照組，年齡21～35歲，平均(28.39±3.02)歲；孕周4～12周，平均(8.28±2.35)周。2組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可對比性。知情同意書均由患者及其家屬簽署，且經本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 入選標準

URSA患者既往無活產史，自身抗體陰性；對照組有活產史，無自然流產、死胎或死產史，孕期無腹痛及陰道出血，B超提示胚胎發(fā)育正常。排除標準：精神障礙者；嚴重器官功能異常者；有染色體異常、生殖道解剖異常、內分泌異常等。

1.3 檢測方法

經患者知情同意后，采集研究對象的部分蛻膜組織和外周血，以磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡漂洗蛻膜，2 h內分離單個核細胞，重懸后備用。分離外周血和蛻膜組織中單個核細胞。單個核細胞中CD3+PD-1+T細胞的表達檢測：取5 μL的CD3-FITC及PD-1-PE加入100 μL PBMCs懸液，設立同型對照，室溫15 min避光孵育；加2 mL Buffer洗滌，10 min、300×g離心，棄上清液；加Buffer重懸細胞500 μL，流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司，型號：CyAN-ADP)檢測CD3+PD-1+T細胞的表達情況，結果用百分比(%)表示。血漿中細胞因子含量檢測：依據試劑盒操作步驟流程，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測外周血白細胞介素4(IL-4)、白細胞介素10(IL-10)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平。

1.4 評價指標

記錄外周血及脫膜組織CD3+PD-1+T細胞的表達;比較外周血IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的水平。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據由SPSS18.0軟件處理，計量資料采用t檢驗，相關性采用一般線性雙變量Pearson相關性檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 外周血及蛻膜組織CD3+PD-1+T細胞的表達

與對照組相比，URSA組外周血及蛻膜組織CD3+PD-1+T細胞的表達更低(P<0.05)，見表1。

組別n外周血CD3+PD-1+T脫膜組織CD3+PD-1+T對照組2019.98±2.3731.09±4.05URSA組2014.27±1.3820.15±3.13t9.3119.558P<0.001<0.001

2.2 外周血IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的水平

與對照組相比，URSA組IL-4、IL-10水平更低，IFN-γ、TNF-α水平更高(P<0.05)，見表2。

組別nIL-4ρ/(ng·L-1)IL-10ρ/(ng·L-1)IFN-γρ/(pg/mL)TNF-αρ/(ng·L-1)對照組2047.44±8.9216.65±5.0972.87±19.1322.61±9.06URSA組2024.65±9.087.38±2.11188.85±77.5945.52±15.69t8.0077.5246.4915.655P<0.001<0.001<0.001<0.001

2.3 URSA與PD-1和IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平的相關性

經Pearson相關性檢驗，URSA與外周血PD-1、蛻膜PD-1、IL-4、IL-10呈負相關(r<0，P<0.05)；URSA與IFN-γ、TNF-α呈正相關(r>0，P<0.05)。見表3。

表3 URSA與PD-1和IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平的相關性

3 討論

在正常妊娠過程中，胚胎作為一種特殊的同種異體移植物，其在母體內存活并正常發(fā)育，母體的免疫系統(tǒng)需對胚胎產生免疫耐受，而特異性免疫抑制物及非特異性因子，可共同維持母體免疫系統(tǒng)對胚胎的免疫耐受，同時機體的多種免疫學因素通過有機協(xié)調參與妊娠免疫平衡，若胚胎免疫耐受降低，則可能導致流產[3-4]。

目前，URSA的免疫因素研究主要包含經典B7途徑的CD28、CTLA-4等，和Treg細胞及其相關的Th細胞因子。PD-1屬于細胞負性調節(jié)分子，可抑制T細胞活化，增殖負性調控免疫應答，并在調節(jié)免疫耐受、微生物感染及腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。本研究結果顯示，與對照組相比，URSA組外周血及蛻膜組織CD3+PD-1+T細胞的表達更低，IL-4、IL-10水平更低，IFN-γ、TNF-α水平更高；經Pearson相關性檢驗，URSA與外周血PD-1、蛻膜PD-1、IL-4、IL-1呈負相關(r<0，P<0.05)，與IFN-γ、TNF-α呈正相關(r>0，P<0.05)，提示URSA患者外周血和蛻膜組織中CD3+PD-1+T細胞的表達降低，通過調節(jié)多種細胞因子，參與URSA發(fā)生。PD-1對維持免疫耐受及母胎免疫平衡，抑制免疫排斥具有重要意義，在正常妊娠中，PD-1可結合其配體PD-L1，負性調節(jié)T細胞受體信號，降低Th1細胞的增殖，阻礙IFN-γ、TNF-α等促炎因子的產生，同時激活Th2細胞，使IL-4、IL-10等抑炎因子處于高表達，進而維持免疫耐受[5]。IFN-γ對胚胎具有毒性作用，會抑制胚胎正常發(fā)育，導致流產現(xiàn)象[6]。但在胚胎正常發(fā)育過程中，TNF-α會與TNF受體大量結合，進而阻礙滋養(yǎng)細胞的生長、繁殖，干擾胚胎發(fā)育的營養(yǎng)供給，使胚胎著床難度增加[7]。IL-4、IL-10可維持正常妊娠，減少流產現(xiàn)象。因PD-1對單核細胞的抑制作用減弱，使URSA患者體內處于高水平的炎癥狀態(tài)，抑炎性細胞因子減少，促炎因子增多,從而參與URSA發(fā)病[8]。造成URSA的主要原因是由于免疫耐受遭到破壞,但其具體機制需進一步研究和探討[9]。

總之，PD-1通過調節(jié)多種細胞因子而影響免疫平衡，參與URSA發(fā)病，可為治療URSA潛在靶點提供理論依據。