楊舟 徐哲 焦磊 王珊 馬琳

國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院皮膚科100045

通信作者：馬琳，Email：bch_maleen@aliyun.com

著色性干皮?。▁eroderma pigmentosum，XP）是一組罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病，其發(fā)病機(jī)制為部分基因突變導(dǎo)致DNA 損傷修復(fù)能力受損，從而引發(fā)光敏、皮膚損傷、眼部病變、神經(jīng)損害、惡性腫瘤、發(fā)育障礙等。皮膚癌為XP 患者的主要死因，神經(jīng)退行性疾病是第二大死因［1］。目前報(bào)道XP 共有7個(gè)互補(bǔ)型（XPA、XPB、XPC、XPD、XPE、XPF、XPG）和1 個(gè)變異型（XPV），分別對(duì)應(yīng)8 種基因（XPA、ERCC3、XPC、ERCC2、DDB2、ERCC4、ERCC5、POLH）突變［2］。本研究采用高通量測(cè)序?qū)? 例XP患者進(jìn)行全外顯子組測(cè)序（whole ? exome sequencing，WES），結(jié)合Sanger測(cè)序驗(yàn)證，明確其分別為XPD型及XPG型。

資料與方法

一、病歷資料

例1 男，3 歲，出生時(shí)皮膚外觀正常，日曬后面部出現(xiàn)紅斑和腫脹，隨后皮膚粗糙、干燥，逐漸出現(xiàn)散在的雀斑樣病變和色素痣。皮疹夏季加重，以光暴露部位為主。近1年出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)，行走時(shí)易跌倒。體檢：面、耳、頸部和雙手背可見(jiàn)大量褐色斑點(diǎn)、斑片，間雜色素減退斑，散在疣狀丘疹，軀干散發(fā)黑褐色斑丘疹（圖1）。神經(jīng)系統(tǒng)檢查：步態(tài)不穩(wěn)，易跌倒，四肢肌張力正常，深部腱反射可引出；指鼻試驗(yàn)、閉目難立征、輪替試驗(yàn)均陰性，未見(jiàn)共濟(jì)失調(diào)；語(yǔ)言發(fā)育落后，無(wú)法表達(dá)完整的句子，智力篩查落后于正常同齡兒范圍。其余系統(tǒng)檢查未見(jiàn)明顯異常。眼科檢查正常；純音測(cè)聽(tīng)未發(fā)現(xiàn)感音性耳聾；頭顱磁共振成像檢查大致正常，未見(jiàn)腦萎縮、腦室擴(kuò)張、基底節(jié)及大腦皮質(zhì)鈣化等。

例2 男，1 歲5 個(gè)月，生后3 個(gè)月日曬后面部出現(xiàn)輕度潮紅腫脹，后逐漸出現(xiàn)面部褐色斑點(diǎn)。體檢：面部散在褐色斑點(diǎn)、斑片，伴少許色素減退性斑（圖2）。體檢：神經(jīng)及其他系統(tǒng)未見(jiàn)異常。眼科、聽(tīng)力檢查正常。

2例患兒均為第1胎第1產(chǎn)，父母非近親結(jié)婚，無(wú)類(lèi)似疾病家族史。囑患者防曬、避光，隨訪2年，2例患兒皮損均較前有所增多，未出現(xiàn)惡性腫瘤。

二、方法

1.標(biāo)本采集：用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管收集患兒及其父母外周靜脈血3 ml，使用北京天根生化科技有限公司DNA 提取試劑盒提取DNA（總量＞10 μg，50 mg/L）。本研究符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》（https://www.wma.net/policies?post/wma?declaration?of?helsinki?ethical?principles?for?medical?research?involving?human?subjects/）的要求，患兒監(jiān)護(hù)人及健康對(duì)照同意基因檢測(cè)并簽署知情同意書(shū)。

2.基因突變檢測(cè)：①WES測(cè)序，稀釋DNA后采用Covaris 超聲儀隨機(jī)分解成小片段DNA（180 ～280 bp），后經(jīng)探針雜交和外顯子區(qū)序列捕獲，制備文庫(kù)并質(zhì)檢，在北京康旭醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所應(yīng)用美國(guó)Illumina 公司的Hiseq X Ten 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用BWA（v0.7.15）軟件將測(cè)序read與人類(lèi)參考基因組對(duì)比，應(yīng)用GATK（v3.6）軟件檢測(cè)單核苷酸變異和插入/缺失突變；②注釋分析，使用ANNOVAR 注釋軟件注釋變異在基因和轉(zhuǎn)錄本中的位置，基因相關(guān)注釋涉及RefSeq、Ensembl、UCSC等數(shù)據(jù)庫(kù)，利用千人基因組、GnomAD、TOPMED 等數(shù)據(jù)庫(kù)注釋變異在人群中的頻率，使用蛋白損傷分析工具PolyPhen?2、SIFT 及Mutation Taster 進(jìn)行致病性分析，利用OMIM、HGMD、ClinVar 等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)疾病進(jìn)行注釋?zhuān)攸c(diǎn)關(guān)注著色性干皮病相關(guān)基因XPA、ERCC3、XPC、ERCC2、DDB2、ERCC4、ERCC5 及POLH；③Sanger測(cè)序驗(yàn)證，針對(duì)單基因所需要驗(yàn)證的位點(diǎn)所在外顯子/內(nèi)含子的上下游序列設(shè)計(jì)引物（表1），對(duì)患兒突變位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s、60 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸45 s、共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物純化后用ABI 3 730測(cè)序儀進(jìn)行Sanger雙向測(cè)序，獲得數(shù)據(jù)后對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，與Ensembl genome browse 90公布的序列比對(duì)分析。進(jìn)一步對(duì)患兒父母進(jìn)行驗(yàn)證，確定突變來(lái)源。

圖1 例1臨床表現(xiàn) 面部（1A）、背部（1B）、頸部（1C）、雙手背（1D）散發(fā)大量褐色斑點(diǎn)、斑片，伴色素減退斑，散發(fā)疣狀丘疹 圖2 例2面部散發(fā)褐色斑點(diǎn)、斑片，伴少許色素減退斑

結(jié) 果

例1存在ERCC2基因復(fù)合雜合突變，即父源突變c.1805G＞A（p.Gly602Asp）和母源突變c.586C＞T（p.Arg196Ter）（圖3），患兒符合XPD 型。例2 存在ERCC5 基因復(fù)合雜合突變，即父源突變c.2533+2T＞C 和母源突變c.2453C＞T（p.Ala818Val）（圖4），患兒符合XPG 型。例1 的ERCC2 基因突變c.586C＞T導(dǎo)致編碼第196號(hào)氨基酸Arg的密碼子變成終止密碼子，為無(wú)義突變；例2 的ERCC5 基因突變c.2533+2T＞C為編碼區(qū)第2 533位核苷酸后11位內(nèi)含子中第2位核苷酸由T變?yōu)镃，為剪切變異，經(jīng)fruitfly 網(wǎng)站（www.fruitfly.org/seq_tools）剪切位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)，突變將導(dǎo)致原有的剪切位點(diǎn)散失，很可能無(wú)法正常剪切，導(dǎo)致蛋白功能出現(xiàn)異常。以上兩個(gè)突變既往未見(jiàn)報(bào)道，在千人基因組、GnomAD、TOPMED 等健康人群對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)或頻率極低，不屬于多態(tài)性位點(diǎn)。而ERCC2 基因突變c.1805G＞A 和ERCC5 基因突變c.2453C＞T 為已報(bào)道的致病性變異，使用SIFT、Polyphen?2和MutationTaster 軟件對(duì)2 個(gè)錯(cuò)義突變c.1805G＞A 和c.2453C＞T 進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，均分別為“有害”、“很可能損害”和“致病性”，顯示其可能致病。Mutation Taster 軟件對(duì)無(wú)義突變c.586C＞T 預(yù)測(cè)為“致病性”，可產(chǎn)生截短蛋白，影響蛋白功能。PolyPhen?2軟件顯示分析c.1805G＞A、c.2453C＞T 及c.586C＞T 突變所在位點(diǎn)均在不同物種間高度保守。

表1 ERCC2和ERCC5基因Sanger測(cè)序引物序列

圖3 例1著色性干皮病患兒ERCC2基因復(fù)合雜合突變測(cè)序圖 3A：先證者發(fā)生錯(cuò)義突變c.1805G＞A（p.Gly602Asp）和無(wú)義突變c.586C＞T（p.Arg196Ter）；3B：先證者父親發(fā)生錯(cuò)義突變c.1805G＞A；3C：先證者母親發(fā)生c.586C＞T無(wú)義突變 圖4 例2著色性干皮病患兒ERCC5基因復(fù)合雜合突變測(cè)序圖 4A：先證者發(fā)生（父源）剪切突變c.2533+2T＞C和（母源）錯(cuò)義突變c.2453C＞T（p.Ala818Val）；4B：先證者父親發(fā)生剪切突變c.2533+2T＞C；4C：先證者母親發(fā)生錯(cuò)義突變c.2453C＞T

討 論

XPA ～XPG型XP是由涉及核苷酸切除修復(fù)機(jī)制的蛋白基因缺陷引起。NER可修復(fù)紫外線、化學(xué)試劑、毒性物質(zhì)及化療藥物等引起的DNA損傷，以及一些因氧化還原過(guò)程產(chǎn)生的損傷［3］。不同分型的XP患者臨床表現(xiàn)有所差異，不同地域種族X(qián)P分型亦有差異。在日本XPA 占較大比例；在美國(guó)XPC 占優(yōu)勢(shì)，其次為XPD 或XPV；在歐洲XPC 占主要比例，其次為XPV［4］。檢索HGMD Pro、PubMed及萬(wàn)方和CNKI 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，截至2019 年10 月，我國(guó)XPA、XPC占優(yōu)勢(shì)［4?7］，XPV并不少見(jiàn)［5，7?8］，而XPD僅報(bào)道2 例［5?6］，XPG 報(bào)道5 例［5?7］。本文報(bào)道XPD、XPG各1例，其中XPD為我國(guó)少見(jiàn)類(lèi)型。與其他地區(qū)人群XPG罕見(jiàn)相比，我國(guó)XPG并不少見(jiàn)，且本例患者癥狀較輕。

XPD（OMIM#278730）由ERCC2 基因突變引起5′?3′ATP 依 賴 的DNA 解 鏈 酶XPD 活 性 降 低 所致［9］。目前已報(bào)道100 余種與疾病相關(guān)的ERCC2基因突變，其基因型與表型關(guān)系復(fù)雜，可導(dǎo)致多種癥狀且嚴(yán)重程度差異很大，如XPD、XPD 合并Cockayne綜合征、毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙、XP合并毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙或腦-眼-面-骨骼綜合征［4，10］。XPD患者常早期發(fā)病，臨床表現(xiàn)嚴(yán)重（但輕于XPA），伴急性曬傷反應(yīng)，雀斑樣色素沉著明顯，皮膚癌發(fā)生率較高［10］。XPD 患者多數(shù)可出現(xiàn)原發(fā)性神經(jīng)元變性導(dǎo)致的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)損害，如進(jìn)行性步態(tài)不穩(wěn)、肌張力低下、痙攣、癲癇等。這些癥狀開(kāi)始于生命早期，亦可較晚出現(xiàn)，特征為髓鞘形成不足或異常、腦萎縮、鈣沉積和腦細(xì)胞異常［3］?；颊呱窠?jīng)系統(tǒng)癥狀不能完全用紫外線損傷修復(fù)缺陷解釋?zhuān)€可能涉及核苷酸切除修復(fù)蛋白參與活性氧產(chǎn)生的損傷修復(fù)［3］。

我國(guó)既往僅報(bào)道2例XPD患者，均為復(fù)合雜合錯(cuò)義突變所致，尚未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，其中p.Gly47Arg 位于HD1 區(qū)，p.Ile595Ser、p.Gly602Asp、p.Arg666Trp 均位于HD2 區(qū)（圖5A）［5?6］。位于HD2區(qū)的突變可導(dǎo)致XP、XP 合并Cockayne 綜合征、毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙或XP 合并毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙表型［4］。本研究中例1 患兒存在錯(cuò)義突變和無(wú)義突變的復(fù)合雜合突變，其錯(cuò)義突變p.Gly602Asp 位于HD2 區(qū)域（圖5A），既往報(bào)道可引起XP合并Cockayne綜合征。另有研究者報(bào)道HD2 區(qū)中突變Arg683Trp 可導(dǎo)致XP表型及神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)展［4］，而Arg683Gln可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)輕度異?；蛲砥诎l(fā)作［10］。p.Arg196Ter 為無(wú)義突變，產(chǎn)生截短蛋白，且位于4FeS 簇區(qū)域（圖5A），推測(cè)其對(duì)酶活性影響較大。位于4FeS 簇區(qū)的突變可導(dǎo)致XP 或毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙表型，其中I199Pfs*52 突變亦可導(dǎo)致XP 表型［11］。本文例1目前已出現(xiàn)大量雀斑樣色素沉著、皮膚異色、疣狀丘疹的XP皮膚表現(xiàn)，以及神經(jīng)系統(tǒng)異常如步態(tài)不穩(wěn)、語(yǔ)言及智力發(fā)育落后。有研究顯示，合并神經(jīng)退行性疾病的XP 患者更早發(fā)生皮膚癌［2］，故該患兒需嚴(yán)格避光防曬，預(yù)防皮膚腫瘤發(fā)生。XP 患者發(fā)生腦腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)可增加50 倍，包括髓母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、脊髓星形細(xì)胞瘤和神經(jīng)鞘瘤［3］。該患兒目前頭部磁共振成像檢查雖未見(jiàn)明顯異常，仍需密切觀察其神經(jīng)系統(tǒng)癥狀進(jìn)展。

XPG（OMIM 278780）是由ERCC5 基因突變引起結(jié)構(gòu)特異性修復(fù)核酸內(nèi)切酶XPG 活性缺陷所致，目前已報(bào)道50 余種ERCC5 基因突變與疾病相關(guān)。XPG 患者早期發(fā)病，伴急性曬傷反應(yīng)，有明顯的雀斑樣色素沉著，可合并神經(jīng)系統(tǒng)異常、Cockayne 綜合征或腦-眼-面-骨骼綜合征。其表型廣泛，可從輕微到極度受累和進(jìn)行性神經(jīng)元死亡導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)異常［12］。雖有報(bào)道本型患者于20歲可發(fā)生皮膚癌［1］，但英國(guó)一項(xiàng)研究提示，XPG 患者皮膚癌的發(fā)生可能少于其他XP亞型［4］。

圖5 ERCC2和ERCC5蛋白結(jié)構(gòu)及我國(guó)XPD和XPG型著色性干皮病患者基因突變位點(diǎn) 5A：ERCC2共5種突變；5B：ERCC5共8種突變。下劃線指示本研究中突變

我國(guó)既往報(bào)道的5 例XPG 患者中，3 例表現(xiàn)為輕度表型，暫未見(jiàn)腫瘤發(fā)生［5，7］；1 例無(wú)義突變和錯(cuò)義突變（p.Gln233Ter，p.Gly2Trp）患者合并恐懼癥、記憶力差及感覺(jué)神經(jīng)性耳聾［13］；1例復(fù)合雜合無(wú)義突變（p.Gln37Ter，p.Lys392Ter）患者合并智力減退［5］。本研究中例2 表現(xiàn)為輕度癥狀，存在剪切突變c.2533+2T＞C 和錯(cuò)義突變p.Ala818Val。盡管突變均位于核酸內(nèi)切酶活性區(qū)域（I區(qū)）內(nèi)（圖5B），但與無(wú)義或移碼突變相比，剪切突變和錯(cuò)義突變對(duì)蛋白的影響可能相對(duì)較小，保留了一些殘留功能而導(dǎo)致輕癥。既往研究者推測(cè)ERCC5基因的蛋白截短突變可導(dǎo)致XPG/Cockayne 綜合征，攜帶至少1 個(gè)ERCC5 非截短突變的患者可能具有輕度XPG 表型［14］，本研究結(jié)果支持該推測(cè)，并顯示I區(qū)的錯(cuò)義和剪切突變亦可導(dǎo)致輕癥表型。但有文獻(xiàn)報(bào)道兩姐弟患者核酸內(nèi)切酶I 區(qū)純合錯(cuò)義突變p.Leu778Pro導(dǎo)致輕度XP 皮膚表型合并輕微神經(jīng)異常［15］。本研究中患兒年齡較小，仍需進(jìn)一步觀察是否出現(xiàn)遲發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。

本文提醒臨床醫(yī)生需提高對(duì)XP早期臨床表現(xiàn)的認(rèn)識(shí)，以期早診斷、早防治。XPG 患者早期臨床表現(xiàn)可較為輕微；合并神經(jīng)系統(tǒng)異常的患者除XPA外，應(yīng)注意XPD 的可能。由于本病致病基因較多，臨床表型復(fù)雜，單獨(dú)應(yīng)用Sanger 測(cè)序費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且費(fèi)用較高，采用高通量WES 結(jié)合Sanger 測(cè)序驗(yàn)證的方法可快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)地進(jìn)行基因診斷和分型，進(jìn)一步指導(dǎo)預(yù)后及遺傳咨詢。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突