林福全 洪為松 周妙妮 許文 金嶸 許愛娥

杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科310009

通信作者：許愛娥，Email：xuaiehz@msn.com

目前認(rèn)為，白癜風(fēng)的發(fā)病是皮膚全層細(xì)胞群如角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞等共同作用的結(jié)果［1］。既往的白癜風(fēng)研究基本局限于單純黑素細(xì)胞或者共培養(yǎng)的黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞，但這些研究不僅存在異質(zhì)性，也不能充分反映白癜風(fēng)皮膚原位水平的狀態(tài)和相互作用。近年單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA?Seq）技術(shù)迅猛發(fā)展，該技術(shù)可以為每個細(xì)胞創(chuàng)建一個單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄組文庫，經(jīng)降維分析將文庫聚類到不同的細(xì)胞群中，更為直接地區(qū)分特定疾病中的關(guān)鍵細(xì)胞群及轉(zhuǎn)錄譜［2］。

本研究通過單細(xì)胞RNA測序?qū)】等撕桶遵帮L(fēng)患者皮膚組織進(jìn)行離散亞群鑒定和關(guān)鍵分子標(biāo)注，通過尋找關(guān)鍵的細(xì)胞亞群和空間分布以及關(guān)鍵功能基因來揭示白癜風(fēng)皮膚中的關(guān)鍵細(xì)胞譜系，進(jìn)而了解不同病期白癜風(fēng)皮損全層細(xì)胞的生理狀態(tài)。

材料與方法

一、標(biāo)本收集及分離

2019 年9 月于杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科門診收集2 例健康人（無免疫性及系統(tǒng)性疾?。┱Ｆつw和2例非節(jié)段型穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者皮損標(biāo)本，取材部位均為腰腹部。其中，2 例健康人均為男性，年齡26、38 歲；2 例白癜風(fēng)患者亦為男性，年齡31、35 歲。本研究獲得安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（20170224），受試者均簽署知情同意書。對獲得的全層皮膚進(jìn)行脂肪分離后放入低鈣基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，用胰蛋白酶（美國Thermo Scientific 公司）解離成單個細(xì)胞，37 ℃下孵育15 min。用40 μm過濾器過濾解離的細(xì)胞懸液，用培養(yǎng)基洗滌，用死細(xì)胞去除試劑盒（美國Miltenyi 公司）在scRNA?seq測序前去除死細(xì)胞。將分選的細(xì)胞1 000 g離心3 min，并重懸于含0.04%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中。后續(xù)細(xì)胞質(zhì)檢、cDNA 片段標(biāo)記及測序均在杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司完成。

二、單細(xì)胞微流控擴(kuò)增及高通量檢測

將皮膚細(xì)胞濃度調(diào)整至700 ～1 200 個/μl，將含有barcode信息的凝膠珠與細(xì)胞和逆轉(zhuǎn)錄及聚合酶的混合物結(jié)合，該凝膠珠被位于微流體“雙十字”系統(tǒng)中的油表面活性劑液滴包裹，形成油包水凝珠，流到儲液器中并被收集，凝膠乳自然溶解釋放Barcode 序列，在凝膠體體系中逆轉(zhuǎn)錄cDNA 片段，以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。將所有凝膠乳的PCR 產(chǎn)物混合，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)測序文庫。最后利用Illumina測序平臺的雙端測序模式對建好的文庫進(jìn)行高通量測序。

三、基于10×Genomics高通量測序分析

利用10×Genomics 分析軟件Cell Ranger 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、比對、定量，鑒定回收細(xì)胞，最終得到各細(xì)胞的基因表達(dá)矩陣。后續(xù)采用Seurat 軟件進(jìn)一步對細(xì)胞過濾、標(biāo)準(zhǔn)化、亞群分類、各亞群差異表達(dá)基因分析及標(biāo)記基因篩選。

四、統(tǒng)計分析

用Seurat軟件R語言模塊標(biāo)識scRNA?Seq中轉(zhuǎn)錄亞群的標(biāo)記基因，Wilcoxon 秩和檢驗進(jìn)行測試。用richPathway ReactomePA 軟件進(jìn)行GO 和KEGG途徑富集分析，獨(dú)立樣本t檢驗分析基因富集差異，對P 值進(jìn)行超幾何測試和Benjamini?Hochberg 校正。用SPSS 20.0 軟件對4 個標(biāo)本細(xì)胞亞群比例進(jìn)行卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、皮膚的單細(xì)胞檢測及細(xì)胞亞群鑒別注釋

本研究中，單細(xì)胞懸液上樣濃度為300 ～700 細(xì)胞/μl，上樣體積＜10 μl，單樣本捕獲量設(shè)定為3 000個細(xì)胞，上樣細(xì)胞得率為75%～80%，細(xì)胞捕獲偏離差異系數(shù)低于8%。檢測數(shù)據(jù)具有較好的可控性和可靠性。共檢測11 000余個細(xì)胞，平均每個細(xì)胞基因檢測數(shù)為2 094。根據(jù)標(biāo)記基因的注釋，共區(qū)分出19種細(xì)胞亞群，其中角質(zhì)形成細(xì)胞占85%～92%，4 個標(biāo)本間角質(zhì)形成細(xì)胞總量占比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.42，P ＞0.05）。通過注釋標(biāo)記，還發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞、神經(jīng)及黑素細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、組織干細(xì)胞以及以樹突細(xì)胞和T細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞群，兩組間樹突細(xì)胞和T細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞群及內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05），組織干細(xì)胞亞群在白癜風(fēng)皮損中構(gòu)成比顯著低于正常皮膚（0.69%比1.34%，χ2= 6.54，P ＜0.05）。見圖1，表1。

二、角質(zhì)形成細(xì)胞及成纖維細(xì)胞在白癜風(fēng)皮損細(xì)胞亞群中的分布及定位

圖1 單細(xì)胞亞群分類及分布 簇號0 ～11、17分別代表角質(zhì)形成細(xì)胞亞群0 ～11、12，12代表抗原提呈細(xì)胞及T細(xì)胞，13代表神經(jīng)及黑素細(xì)胞，14、16分別代表組織干細(xì)胞1、2，15 代表內(nèi)皮細(xì)胞，18 代表成纖維細(xì)胞。1A：每個點代表1個細(xì)胞，不同顏色表示不同樣本的細(xì)胞；左圖為正常皮膚和白癜風(fēng)皮損所有細(xì)胞亞群的疊加，右圖基于所有細(xì)胞的19個亞群分布。1B、1C：分別表示正常皮膚和白癜風(fēng)皮損的細(xì)胞亞群分類情況；左圖為所有細(xì)胞分布，右圖為不同細(xì)胞亞群的數(shù)量和分布

白癜風(fēng)皮損成纖維細(xì)胞存在缺失和數(shù)量不足，在2 例白癜風(fēng)皮損標(biāo)本中均未檢測出18 號成纖維細(xì)胞，但正常皮膚中成纖維細(xì)胞比例分別為0.26%和0.65%（P ＜0.01）。見表1。

角質(zhì)形成細(xì)胞的分布注釋和擬時序分化分析顯示，白癜風(fēng)皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞亞群5、6、10、12占比均高于正常皮膚（表1），χ2值分別為216.34、284.43、23.38、68.69，均P ＜0.01。而且，上述4種細(xì)胞亞群在白癜風(fēng)皮損中均位于角質(zhì)形成細(xì)胞外圍，是成熟分化較為末端的細(xì)胞，其中角質(zhì)形成細(xì)胞亞群5 和10 位于下端，6 和12 位于左上端，靠近成纖維細(xì)胞，見圖1C。

三、不同角質(zhì)形成細(xì)胞亞群的標(biāo)記基因表達(dá)

對不同細(xì)胞群體中上調(diào)的表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)熱圖匯總，結(jié)果見圖2A。從不同細(xì)胞群體的前10 條標(biāo)記基因表達(dá)熱圖中可以看出，不同類型的細(xì)胞亞群差異表達(dá)顯著，明亮區(qū)域的細(xì)胞雖然占比較少，但是明顯區(qū)別于其他細(xì)胞。而且，角質(zhì)形成細(xì)胞與神經(jīng)及黑素細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等功能和分化來源完全不同。在這些角質(zhì)形成細(xì)胞群中，編號較大的角質(zhì)形成細(xì)胞亞群雖然占比較少，但是其顯示的標(biāo)記基因表達(dá)卻更顯著和獨(dú)特，圖2A中角質(zhì)形成細(xì)胞5、6、9 和10 均有超過20條以上標(biāo)記基因表達(dá)，這些基因不僅數(shù)量更多，表達(dá)差異也更顯著。角質(zhì)形成細(xì)胞亞群5、6、10的熱力圖見圖2B。

四、與白癜風(fēng)相關(guān)的特殊功能分布的角質(zhì)形成細(xì)胞群鑒別與分析

從圖3 看出，角質(zhì)形成細(xì)胞亞群5 主要高表達(dá)角蛋白15（KRT15）、胞外基質(zhì)蛋白（POSTN）、膠原蛋白17（COL17）以及S100A2 基因。GO 富集分析顯示，相對于其他角質(zhì)形成細(xì)胞亞群，角質(zhì)形成細(xì)胞亞群5細(xì)胞黏附及細(xì)胞連接功能相關(guān)的350余個基因占比高（P ＜0.01），同時KEGG富集分析也顯示，細(xì)胞骨架黏附及ECM 通路是主要的高表達(dá)通路（P ＜0.01）。

表1 正常皮膚及白癜風(fēng)皮損中數(shù)量差別較大的幾組細(xì)胞亞群的細(xì)胞數(shù)占樣本中細(xì)胞總數(shù)的比例（%）

圖2 標(biāo)記基因在各個細(xì)胞群體的表達(dá)差異 2A：對所有細(xì)胞亞群的前10條基因進(jìn)行熱力圖繪制，圖中黃色代表基因表達(dá)水平升高，顏色的亮度代表升高的程度，黃亮度最高的區(qū)域代表對應(yīng)細(xì)胞亞群中差異顯著的特異性標(biāo)記基因；2B：角質(zhì)形成細(xì)胞亞群5、6、10的熱力圖

角質(zhì)形成細(xì)胞亞群6 特異性高表達(dá)若干個標(biāo)記基因，包括分泌型卷曲相關(guān)蛋白SFRP1、縫隙連接蛋白GJB家族、SOX9、KRT6等，這些基因均與細(xì)胞分化功能相關(guān)。GO 分析顯示，該細(xì)胞群差異基因功能主要集中在細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、角質(zhì)形成細(xì)胞分化功能以及細(xì)胞外識別傳輸及轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。KEGG富集分析顯示，氧化應(yīng)激通路（如白細(xì)胞介素17通路）等應(yīng)激傳導(dǎo)通路是該群細(xì)胞主要的特征性信號通路。

圖3 角質(zhì)形成細(xì)胞亞群5前10位標(biāo)記基因表達(dá)分布與GO分析和KEGG分析 3A：單基因在單細(xì)胞水平細(xì)胞亞群中的表達(dá)絕對量和豐度；3B：在細(xì)胞亞群及總細(xì)胞群中的表達(dá)分布及表達(dá)水平 tSNE，t-分布隨機(jī)近鄰嵌入；3C：差異基因GO富集性散點圖，富集率（rich factor）表示位于該GO功能的差異基因個數(shù)與總基因數(shù)的比值，富集率越大，GO富集程度越高；3D：KEGG富集分析，富集率表示位于該KEGG通路的差異基因數(shù)與總基因數(shù)的比值，富集率越大，KEGG富集程度越高

角質(zhì)形成細(xì)胞亞群10高表達(dá)垂體瘤轉(zhuǎn)化基因1（PTTG1，可抵抗紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用并與細(xì)胞增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)），此外還特異性高表達(dá)CENPF（與細(xì)胞惡性分化相關(guān)）、高遷移率族蛋白B2（HMGB2）、拓?fù)洚悩?gòu)酶2A（TOP2A）、泛素偶聯(lián)酶E2C（UBE2C）基因。GO 分析顯示，其主要與細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、染色體以及RNA/DNA 的結(jié)合表達(dá)功能相關(guān)；KEGG 富集分析顯示，富集通路主要集中在細(xì)胞周期與DNA 修復(fù)通路。而且，與其他角質(zhì)形成細(xì)胞亞群相比，角質(zhì)形成細(xì)胞亞群10 顯示出HMGB家族基因的集體高表達(dá)，如HMGB1/2/3基因差異檢驗顯示，t值分別為156.32、356.68、34.74，均P ＜0.01。

討 論

本研究中，每個細(xì)胞平均檢測2 094個基因，與以前的單細(xì)胞RNA 序列研究［3］相一致。我們在前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，白癜風(fēng)白斑部位角質(zhì)形成細(xì)胞存在易消化、難培養(yǎng)、難傳代的特點，白斑表皮片存在韌性不足的問題。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)顯示，角質(zhì)形成細(xì)胞通過增殖和分化可以分別構(gòu)成屏障層、毛囊和皮脂腺，且許多不同基因的豐度在細(xì)胞分化過程中波動，從而形成具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄譜特征的細(xì)胞亞群［4］。我們通過建立正常皮膚和白癜風(fēng)白斑的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，以期為深刻認(rèn)識和理解白癜風(fēng)奠定基礎(chǔ)。

本研究對皮膚細(xì)胞亞群的鑒別和注釋參考傳統(tǒng)皮膚細(xì)胞分類法進(jìn)行，所得細(xì)胞亞群主要包括角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)及黑素細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、組織干細(xì)胞、以樹突細(xì)胞和T 細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞群等，其中，白癜風(fēng)皮損標(biāo)本未見成熟分化的成纖維細(xì)胞群，未成熟分化的干細(xì)胞亞群差異在兩組間不顯著。就白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制而言，缺失的這一小部分成纖維細(xì)胞是否是發(fā)病的關(guān)鍵值得進(jìn)一步研究。研究者通過觀察非皮損部位成纖維細(xì)胞特征發(fā)現(xiàn)，白癜風(fēng)患者成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，且α 平滑肌肌動蛋白高表達(dá)，胞內(nèi)活性氧過度積累。此外，細(xì)胞體積增大，黏附蛋白增加，與黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞一樣呈現(xiàn)衰老表型［5］。結(jié)合本研究結(jié)果，推測白癜風(fēng)白斑部位的成纖維細(xì)胞缺失對皮膚微環(huán)境的滋養(yǎng)和修復(fù)功能障礙可能是影響白癜風(fēng)發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。本研究中未在白癜風(fēng)皮損處發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞，也可能與取材方法和檢測技術(shù)有關(guān)。

此外，通過對細(xì)胞數(shù)量最多的角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行亞群分類及注釋，我們發(fā)現(xiàn)，在總細(xì)胞比例不變的情況下，部分角質(zhì)形成細(xì)胞亞群在白癜風(fēng)皮損組織中占優(yōu)勢，如角質(zhì)形成細(xì)胞亞群5、6、10、12，這幾組細(xì)胞亞群不僅在白癜風(fēng)中數(shù)量居多，在t 分布隨機(jī)鄰居嵌入（tSNE）分布圖上也遠(yuǎn)離主角質(zhì)形成細(xì)胞群，且都標(biāo)記基因，例如角質(zhì)形成細(xì)胞亞群5高表達(dá)KRT15、POSTN、COL17 以及S100A2 基因，亞群6 特異高表達(dá)SFRP1、GJB家族、SOX9及KRT6基 因，亞 群10 高 表 達(dá)PTTG1、CENPF、HMGB2、TOP2A、UBE2C基因。這幾群細(xì)胞正是由于有獨(dú)特的表達(dá)特征譜，不僅在角質(zhì)形成細(xì)胞分化程度上不同于其他細(xì)胞，其功能也與白癜風(fēng)疾病發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。角質(zhì)形成細(xì)胞亞群5 與細(xì)胞黏附功能最為密切，角質(zhì)形成細(xì)胞亞群6與細(xì)胞應(yīng)激水平相關(guān)，角質(zhì)形成細(xì)胞亞群10 與細(xì)胞周期和內(nèi)穩(wěn)態(tài)關(guān)系緊密。有研究顯示，白癜風(fēng)患者來源的角質(zhì)形成細(xì)胞具有凋亡傾向，細(xì)胞因子分泌異?？赡芘c局部黑素細(xì)胞缺失相關(guān)［1］。還有研究顯示，白癜風(fēng)患者角質(zhì)形成細(xì)胞鈣攝取能力下降，細(xì)胞生存時間縮短，衰老標(biāo)志分子高表達(dá)，不能通過共培養(yǎng)維持黑素細(xì)胞生長［6］。結(jié)合上述研究，推測異常的角質(zhì)形成細(xì)胞在白癜風(fēng)患者角質(zhì)形成細(xì)胞總數(shù)中占比可能不到20%，但是其異常狀態(tài)與白癜風(fēng)發(fā)病及進(jìn)展密切相關(guān)，例如角質(zhì)形成細(xì)胞亞群6。

本研究表明，角質(zhì)形成細(xì)胞亞群5和10位置相連，表達(dá)譜相似并且重疊較多，角質(zhì)形成細(xì)胞亞群10 的HMGB 家族特異性高表達(dá)可能和亞群5 的黏附功能密切相關(guān)。核蛋白高遷移率族蛋白超家族的生物學(xué)功能主要調(diào)節(jié)DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)等，是真核細(xì)胞基因調(diào)控的動力體現(xiàn)者，它們在染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能及基因表達(dá)調(diào)控過程中均發(fā)揮重要作用。有報道外部刺激如氧化應(yīng)激和強(qiáng)烈的紫外線照射會引發(fā)角質(zhì)形成細(xì)胞釋放HMGB1，HMGB1 的升高觸發(fā)自分泌HMGB1 易位和黑素細(xì)胞抗原的釋放，抑制Nrf2 和下游抗氧化基因的表達(dá)，誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡，參與促進(jìn)樹突細(xì)胞的成熟和活化，從而參與白癜風(fēng)的病理過程，促使白癜風(fēng)發(fā)病［7?8］。此外，白癜風(fēng)皮損中HMGB1表達(dá)較正常皮膚更高，且與疾病活動性相關(guān)［9］。此外紫外線及UVB照射均能有效激活表皮細(xì)胞HMGB家族的表達(dá)。

最新研究顯示，除了黑素細(xì)胞，白癜風(fēng)患者的角質(zhì)形成細(xì)胞膜上E鈣黏蛋白也存在表達(dá)異常，并且E 鈣黏蛋白的表達(dá)量與白癜風(fēng)的疾病活動度密切相關(guān)［10］。由此可見，E鈣黏蛋白在白癜風(fēng)的發(fā)病中具有重要作用，但導(dǎo)致E鈣黏蛋白功能異常的誘發(fā)因素以及其參與黑素細(xì)胞發(fā)病的具體作用機(jī)制罕見報道。對于這些角質(zhì)形成細(xì)胞亞群的其他基因組表達(dá)水平和功能以及和不同細(xì)胞間相互作用的方式和關(guān)系有待深入探索，對于白癜風(fēng)皮損單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平的結(jié)果也有待進(jìn)一步驗證和挖掘。本研究的樣本量較小，只比較了2例白癜風(fēng)皮損和正常對照皮膚，因此結(jié)果比較初步，有一定的局限性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突