陳志明 王小坡 孫建方 楊勇

1中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病醫(yī)院遺傳病中心，南京210042；

2中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病醫(yī)院病理科，南京210042

通信作者：王小坡，Email：13770757675@163.com；楊勇，Email：yyang@pumcderm.cams.cn

Legius 綜 合 征（Legius syndrome，LS；OMIM 611431）臨床表現(xiàn)與Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤?。╪eurofibromatosis type 1，NF1；OMIM 162200）相似，又稱為類Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤樣綜合征（neurofibromatosis type 1?like syndrome），是由生殖細胞系SPRED1 基因雜合失功能突變引起的罕見常染色體顯性遺傳病，表現(xiàn)為多發(fā)咖啡斑，可伴有腋窩和/或腹股溝雀斑、巨頭畸形，但缺少神經(jīng)纖維瘤、視神經(jīng)通路神經(jīng)膠質(zhì)瘤、虹膜Lisch 結(jié)節(jié)、骨骼異常等NF1 典型癥狀。目前國外有100 余例LS 報道［1］，而國內(nèi)尚未見報道，我們對僅表現(xiàn)為多發(fā)咖啡斑的一個家系進行基因檢測，結(jié)合臨床表現(xiàn)確診為LS。

對象與方法

一、臨床資料

先證者男，12 歲。因軀干、四肢泛發(fā)淡褐色斑12年于我院門診就診。患者出生時軀干即出現(xiàn)數(shù)個咖啡斑，逐漸擴大、增多，無自覺癥狀。平素體健，智力發(fā)育正常，既往史及個人史無特殊。父母非近親結(jié)婚，先證者父母及外祖父母中僅其母親有類似癥狀（圖1）。體檢：一般情況好，發(fā)育正常，各系統(tǒng)均未見異常。皮膚科檢查（圖2A、2B）：軀干、四肢散在10余處邊界清楚、不規(guī)則或橢圓形、米粒至雞蛋大小咖啡色斑，腋窩、腹股溝可見散在淺褐色斑點，未見丘疹結(jié)節(jié)、虹膜Lisch結(jié)節(jié)。實驗室檢查：血、尿常規(guī)和心臟彩色多普勒超聲檢查及脊柱正側(cè)位X 線和頭顱MRI 檢查均未見異常。先癥者母親軀干、四肢多發(fā)大小不一、不規(guī)則咖啡斑（圖2C），腋窩、腹股溝散發(fā)淺褐色斑點，余無特殊所見。

二、方法

1.全外顯子組測序：本研究經(jīng)中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準［（2019）臨審第（005）號］，患者監(jiān)護人簽署知情同意書。用乙二胺四乙酸抗凝管采集先證者、先證者父母及外祖父母外周血各2 ml，用Blood DNA Mini Kit（德國Qiagen 公司）提取全基因組DNA，將先證者DNA 送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司，使用PE150 測序系統(tǒng)（美國Illumina 公司）進行人類全外顯子組高通量測序。外顯子測序后獲得原始數(shù)據(jù)，通過BWA 軟件進行序列比對，采用GATK和VarScan軟件對變異識別，包括對SNP、InDel 等進行檢測、注釋和統(tǒng)計分析。用Annovar 軟件從外部數(shù)據(jù)庫得到檢出的變異頻率、致病信息，對檢出的變異進行注釋。根據(jù)分析結(jié)果，參考dbSNP、人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD）、Exac等數(shù)據(jù)庫找出致病突變。

2.Sanger測序驗證突變：根據(jù)全外顯子組測序檢測到的突變，對家系各成員DNA 標本進行突變位點Sanger 測序驗證。PCR 擴增家系各成員SPRED1 基因第7 外顯子序列。使用PubMed Primer Blast在線設計引物，由北京擎科生物公司合成，正向引物5′?GTGGTATTTAAGACGCAGCC?3′，反向引物5′?CCAGAAATGGTTTCCTTCTG?3′。擴增條件:98 ℃預變性3 min，98 ℃變性10 s、55 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s共35個循環(huán)，之后72 ℃延伸2 min。PCR反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳切膠純化后由北京擎科生物公司測序。測序結(jié)果應用Chromas 軟件分析，并運用DNAMAN 軟件與SPRED1基因參考序列進行比對。

圖1 Legius綜合征患者家系圖

圖2 Legius綜合征先證者及其母親臨床表現(xiàn) 2A：先證者軀干多發(fā)不規(guī)則或橢圓形咖啡斑；2B：先證者腋窩見咖啡斑及不典型雀斑（黃色箭頭指示）；2C：先證者母親軀干多發(fā)不規(guī)則咖啡斑

結(jié) 果

先證者基因組DNA全外顯子組測序結(jié)果分析顯示，與多發(fā)性咖啡斑相關的NF、Noonan 綜合征、Costello 綜合征、LEOPARD 綜合征、Cardio?facio?cutaneous 綜合征和McCune?Albright 綜合征的致病基 因NF1、NF2、PTPN11、KRAS、HRAS、NRAS、BRAF、RAF1、SOS1、LZTR1、MAP2K1、MAP2K2、MAS 均未發(fā)現(xiàn)致病突變，SPRED1 基因第7 號外顯子自第1 220 位核苷酸起發(fā)生19 個堿基雜合缺失（NM_152594，exon7，c.1220_1238del），引起氨基酸序列發(fā)生移碼突變（p.L407fs），成為候選致病突變。進一步對先證者和其父母及外祖父母進行SPRED1基因第7號外顯子PCR擴增及正反向測序發(fā)現(xiàn)，先證者及患病母親均攜帶該雜合突變，先證者外祖父母、父親均未檢出該突變（圖3），該家系中該突變與疾病符合共分離。綜合臨床表現(xiàn)、病史和基因檢測結(jié)果，認為SPRED1: c.1220_1238del:p.L407fs為該家系致病突變，先證者符合LS診斷。

討 論

圖3 Sanger 測序圖 先證者及母親SPRED1 基因第7 號外顯子從第1 220位核苷酸起發(fā)生堿基雜合缺失（紅色箭頭），先證者外祖父母未檢出該突變

LS 由Brems 等于2007 年首次報道，并且確定該病由SPRED1 基因失功能雜合突變引起［2］。SPRED1 蛋白由444 個氨基酸組成，包括3 個結(jié)構(gòu)域，是腎素血管緊張素系統(tǒng)-絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）重要抑制劑，通過調(diào)節(jié)RAS信號通路控制MAPK 信號轉(zhuǎn)導參與調(diào)節(jié)細胞生長、分化和衰老，對個體正常生長發(fā)育至關重要［3］。除SPRED1基因外，其他相關調(diào)控基因突變導致腎素血管緊張素系統(tǒng)-MAPK信號轉(zhuǎn)導異常后可引起一組遺傳性綜合征群，因臨床表型均可出現(xiàn)顱面畸形、心血管系統(tǒng)異常、皮膚和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，又稱之為神經(jīng)-心臟-面部-皮膚綜合征，包括NF1、LS、Noonan 綜合征、Costello 綜合征、cardio?facio?cutaneous 綜合征和LEOPARD綜合征［4］。

LS 臨床表現(xiàn)為多發(fā)咖啡斑，部分可有腋窩和腹股溝區(qū)雀斑、眼距增寬、巨頭畸形、脂肪瘤，患者可伴有輕度學習障礙，但不發(fā)生神經(jīng)纖維瘤、視神經(jīng)膠質(zhì)瘤和虹膜Lisch 結(jié)節(jié)［1，5］。LS 需與NF1 鑒別診斷，據(jù)估計，高達5%符合美國國立衛(wèi)生研究院診斷NF1 標準的患者實際為SPRED1 基因突變導致的LS，而非NF1［6］。對現(xiàn)有報道病例分析表明，LS并發(fā)癥的嚴重程度以及并發(fā)惡性腫瘤概率均低于NF1［1］，因此早期對這兩種疾病進行鑒別診斷對預后判斷、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷有重要意義。LS 與NF1早期均表現(xiàn)為多發(fā)咖啡斑，而NF1特異性表現(xiàn)需要到一定年齡才發(fā)生，所以通過臨床癥狀早期鑒別診斷較為困難，當皮膚科醫(yī)生接診僅有多發(fā)性咖啡斑伴或不伴腋窩雀斑但缺少NF1 其他相關癥狀的患者時，應考慮到LS 可能并可通過基因檢測進行早期鑒別診斷。對患者進行檢測時需注意的是，NF1 和SPRED1 基因均易發(fā)生大片段缺失［7］，而目前全外顯子組捕獲高通量測序方法無法檢出大片段缺失，因此，當高度懷疑NF1和LS而采用全外顯子組測序未能發(fā)現(xiàn)NF1 或SPRED1 基因致病突變時，須采用多重鏈接探針擴增技術（multiplex ligation dependent probe amplification）排除大片段缺失可能。若基因檢測明確有NF1致病突變，則需嚴格定期至有處理NF1經(jīng)驗的醫(yī)院隨訪，重點監(jiān)測患者實體瘤如視路膠質(zhì)瘤、惡性周圍神經(jīng)鞘膜腫瘤的發(fā)生，骨骼系統(tǒng)異常和神經(jīng)系統(tǒng)異常［8］，而如果檢出SPRED1 致病突變，家長可自行觀察，重點關注患者生長發(fā)育以及學習情況。LS患者一般不需特殊治療，如果咖啡斑影響美觀可選擇激光治療。

本文先證者的母親亦有類似癥狀，基因檢測也檢出與先證者同一突變（SPRED1: exon7:c.1220_1238del:p.L407fs），先證者外祖父母和父親均未檢出該突變，證實該突變?yōu)樾掳l(fā)突變，該新發(fā)突變在千人基因組數(shù)據(jù)庫、HGMD、ExAC EAS數(shù)據(jù)庫以及諾禾致源正常人外顯子突變數(shù)據(jù)庫（NovoDb_WES）中均未見報道。截至目前，HGMD已收錄SPRED1 基因致病突變72 個（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=SPRED1），主要突變類型為小片段缺失/插入（34/72）、錯義/無義突變（27/72），其余為大片段缺失和剪切突變。從目前報道的病例分析，尚未能發(fā)現(xiàn)基因型-臨床表型明顯相關性，SPRED1基因多個外顯子甚至整個基因缺失患者與僅有點突變患者的臨床表型相比無差別，較為特殊的1 例患者出現(xiàn)了腭裂，該患者染色體出現(xiàn)大片段缺失（6.6Mb），缺失片段包含SPRED1 以及另外29 個注釋參考基因［9］，既往研究者認為這些注釋參考基因異?？梢鸫诫窳雅c發(fā)育遲緩［10］。因此，還需要更多LS 患者臨床資料和突變數(shù)據(jù)來分析LS基因型-臨床表型相關性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突