韓慧璞，徐志立，李莉，王月丹，初明，張明波

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連116600；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京100191)

痛風(fēng)是一種以持續(xù)性高尿酸血癥導(dǎo)致尿酸鈉晶體在關(guān)節(jié)及其周圍組織沉積為特征的嘌呤代謝性疾病[1]。痛風(fēng)與嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥直接相關(guān)，可誘發(fā)高血壓、高血脂、動脈粥樣硬化、肥胖、胰島素抵抗等多種疾病，對人類的健康構(gòu)成很大威脅[2]。黃嘌呤氧化酶(XOD)能催化人體中尿酸的形成，是治療高尿酸血癥或痛風(fēng)藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn)[3]。XOD抑制劑作為抗痛風(fēng)藥物，目前臨床上可用的只有別嘌呤醇和非布司他[3]，二者都具有一定的副作用并且發(fā)生率高。例如，在服用別嘌呤醇后，患者有皮膚過敏、肝炎、超敏反應(yīng)綜合征，甚至肝功能損害等副作用[4]。非布司他最常見的副作用為肝功能異常、惡心、皮疹和關(guān)節(jié)痛[5]。因此，研究新的高效低毒的XOD抑制劑具有十分重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用前景。

茵連痛風(fēng)顆粒為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的自制復(fù)方制劑，由茵陳、連錢草、伸筋草組成，具有清熱、利濕、通絡(luò)的功效，用于治療慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明茵連痛風(fēng)顆粒浸膏粉能夠有效抑制尿酸生成，促進(jìn)尿酸代謝，對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有良好的防治作用[6]。劉靜等[7]通過大鼠痛風(fēng)模型確定了茵連痛風(fēng)顆粒中降尿酸的活性部位為黃酮、有機(jī)酸和生物堿類成分，但是具體的活性單體仍不是很清楚。

本論文運(yùn)用分子對接方法，以XOD為靶點(diǎn)對茵連痛風(fēng)顆粒中所含的化學(xué)成分進(jìn)行了篩選，明確了其中對XOD具有抑制作用的活性成分，并對部分代表性成分與XOD的作用模式進(jìn)行分析，為理解茵連痛風(fēng)顆粒治療痛風(fēng)的作用機(jī)制及其作為抗痛風(fēng)藥物進(jìn)一步開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 理論與計(jì)算方法

從中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[8]下載茵連痛風(fēng)顆粒3味中藥所含175種化合物的結(jié)構(gòu)文件。利用AutoDock Tool軟件進(jìn)行處理，把化合物結(jié)構(gòu)由Mol2格式轉(zhuǎn)成AutoDock Vina[9]軟件所需的pdbqt格式，建立可供篩選的化合物數(shù)據(jù)庫。

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org)下載得到XOD的晶體結(jié)構(gòu)(編號：1N5X)。利用ADT軟件對晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行處理，去掉所含的結(jié)晶水，然后為XOD結(jié)構(gòu)添加極性氫原子和原子電荷。根據(jù)晶體中原配體的位置確定對接位點(diǎn)的中心坐標(biāo)為(96.68?、55.72 ?、40.77?)，3個(gè)維度的邊長均為30?。分子對接使用AutoDock Vina軟件完成。在對接過程中，只改變配體的構(gòu)象，而保持XOD的構(gòu)象不變。選擇與XOD結(jié)合能最低的構(gòu)象作為化合物最終的對接結(jié)果。抑制常數(shù)可根據(jù)公式Ki＝exp[△G×1000/(Rcal×T)]換算得到，其中 T＝298 K，Rcal＝1.987 19 cal·(mol·K)-1。除特別聲明外，其余所有參數(shù)均采用默認(rèn)值。

2 結(jié)果

2.1 對接方法的檢驗(yàn) 為了檢驗(yàn)對接方法的可靠性，我們把晶體結(jié)構(gòu)(編號：1N5X)中原有配體(非布司他)與空的XOD晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行對接，比較對接的構(gòu)象和原晶體結(jié)構(gòu)中配體構(gòu)象的差異，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，AutoDock Vina所預(yù)測的結(jié)合構(gòu)象與原配體構(gòu)象基本吻合，只在分子末端的異丙基構(gòu)象稍有所差異。兩個(gè)構(gòu)象的均方根偏差(RMSD)只有0.91?，說明我們所采用的對接方法能夠準(zhǔn)確預(yù)測分子的結(jié)合構(gòu)象。

2.2 分子對接結(jié)果 分子對接結(jié)果表明原配體(非布司他)與XOD的結(jié)合能為-9.6 kcal·mol-1。以非布司他為陽性參照物，我們僅列出了結(jié)合能在-9.0 kcal·mol-1以下的化合物的結(jié)合能及其抑制常數(shù)，如表1所示。從化合物的種類分布來看，我們所篩選出的化合物除了迷迭香酸為酚酸外，其余均為黃酮類、類黃酮類物質(zhì)及其衍生物。動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明痛風(fēng)顆粒中降尿酸的活性部位為黃酮、有機(jī)酸和生物堿類成分[7]。這與我們的對接計(jì)算結(jié)果基本相符。從化合物的來源來看，其中13個(gè)化合物中有9個(gè)來自連錢草，3個(gè)來自茵陳，而來自伸筋草中的只有1個(gè)。由此可見，在茵連痛風(fēng)顆粒中對XOD具有抑制作用的成分主要來自連錢草。

表1 茵連痛風(fēng)顆粒中單體成分與黃嘌呤氧化酶結(jié)合能△G及抑制常數(shù)Ki

2.3 活性化合物的結(jié)合模式分析 為了進(jìn)一步明確這些活性成分與XOD的具體結(jié)合模式，我們對非布司他和3個(gè)代表性化合物，即木犀草素、木犀草苷和迷迭香酸與XOD的結(jié)合構(gòu)象，進(jìn)行了比較分析(見圖2)。晶體結(jié)構(gòu)表明非布司他中的羧基可以與XOD中的ARG880和THR1010形成氫鍵，同時(shí)非布司他中的噻唑環(huán)可以與XOD中PHE914和PHE1009形成-相互作用。非布司他中的苯基和末端的烷氧基則與 XOD中的 LEU014、VAL1011、LEU873、LEU648和PHE649等疏水性殘基形成疏水相互作用。根據(jù)分子對接結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)木犀草素、木犀草苷、迷迭香酸與XOD的結(jié)合模式與非布司他的十分相似，都是結(jié)合在活性位點(diǎn)的疏水區(qū)。3個(gè)化合物所含有的鄰苯二羥基片段，其作用與非布司他中的噻唑環(huán)相當(dāng)。鄰苯二羥基結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)PHE914和PHE1009形成-相互作用，其中的兩個(gè)酚羥基則可以分別與ARG880和THR1010形成氫鍵相互作用。木犀草素和木犀草苷中苯并吡喃片段作用和非布司他中的苯基相類似，可以與周圍的疏水性殘基形成疏水相互作用。除此之外，木犀草素中的羰基可以和XOD中SER876形成氫鍵相互作用，而木犀草苷則通過其糖基中的羥基與SER876形成氫鍵。所以從相互作用的位點(diǎn)數(shù)來看，木犀草素與木犀草苷與XOD結(jié)合能力基本相當(dāng)。木犀草苷中親水性糖基的存在，使其在與XOD結(jié)合時(shí)需要較高的去溶劑化能。這可能是其活性比木犀草素弱的主要原因。迷迭香酸中不具有苯并吡喃這樣的疏水片段，因此和黃酮類化合物相比疏水作用弱一些，但相應(yīng)位置上的羧基可以與XOD中的GLU802和ASN768形成氫鍵相互作用。同時(shí)，迷迭香酸末端的鄰苯二羥基片段中的苯環(huán)可以與PHE649形成p-p相互作用，其中的酚羥基還可與LEU648形成氫鍵相互作用。因此，迷迭香酸對XOD也具有一定的抑制能力。

3 討論

茵連痛風(fēng)顆粒在臨床上對于痛風(fēng)疾病的治療具有很好的療效，而且副作用小，適合長期服用。但是由于成分復(fù)雜，分離純化難度大，對于其藥效成分的研究只能停留在有效部位的層次上，而無法給出具體的活性單體[7]?；诜肿訉拥乃幬锾摂M篩選方法是依據(jù)化合物與藥物靶標(biāo)的結(jié)合強(qiáng)度來預(yù)測藥物活性。由于該方法不需要預(yù)先得到純的單體成分，因此在中藥活性成分的預(yù)測和篩選上具有廣泛的應(yīng)用[10]。

本論文利用虛擬篩選方法對茵連痛風(fēng)顆粒所含的化合物進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明茵連痛風(fēng)顆粒中有13種化合物對黃嘌呤氧化酶具有較強(qiáng)的抑制作用。根據(jù)我們的預(yù)測，槲皮素對XOD的抑制常數(shù)為0.91 μmol·L-1。這與Nagao等[11]的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果(0.28 μmol·L-1)基本一致。迷迭香酸和木犀草素對XOD的抑制作用，也分別有實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道[12-13]。對接結(jié)果表明黃酮類苷元(木犀草素)活性要強(qiáng)于其糖苷(木犀草苷)，這也與既有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致[14]。所預(yù)測的13個(gè)活性成分中有9個(gè)來自連錢草，說明連錢草在抑制XOD的過程中發(fā)揮主要作用。從化合物結(jié)構(gòu)來看，多數(shù)活性成分為黃酮類物質(zhì)。進(jìn)一步的作用模式分析表明，這些活性成分可分別通過p-p相互作用、疏水相互作用和氫鍵相互作用與XOD相結(jié)合。我們的研究結(jié)果表明直接抑制黃嘌呤氧化酶從而降低尿素的生成是茵連痛風(fēng)顆粒治療痛風(fēng)的可能機(jī)制之一。這為茵連痛風(fēng)顆粒治療痛風(fēng)的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步開發(fā)提供一定的理論指導(dǎo)。