林春雨，郟建新，康琪，吳志強，李明玉

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島266003；2.廈門大學(xué)藥學(xué)院，福建廈門361102)

糖尿病是一種復(fù)雜的代謝性紊亂疾病，主要表現(xiàn)為體內(nèi)血糖調(diào)節(jié)失衡導(dǎo)致的高血糖癥狀，持續(xù)的高血糖導(dǎo)致的血管、心臟、眼睛、腎臟和神經(jīng)受損等并發(fā)癥[1-2]。體內(nèi)血糖主要受α細胞分泌的胰高血糖素和β細胞分泌的胰島素來共同調(diào)節(jié)。雖然1型和2型糖尿病的核心機制都是由于胰島β細胞的破壞和功能不足導(dǎo)致胰島素的絕對和相對缺乏[3-4]。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，胰島α細胞在血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和糖尿病發(fā)病機制中起重要的調(diào)控作用，這使有關(guān)α細胞研究越來越受到關(guān)注[5]。胰高血糖素主要的功能是在禁食的狀態(tài)下控制血糖水平，刺激肝糖產(chǎn)生為機體提供的葡萄糖，其濃度受到血糖水平的負性調(diào)控，若在血糖升高的情況下能夠有效地抑制胰高血糖素的分泌或者阻斷胰高血糖素受體信號通路，即可起到降低血糖的作用，因此針對其信號通路作為靶點也成為開發(fā)新型抗糖尿病藥物的熱點[6-7]。因為α細胞的功能和發(fā)育都與糖尿病的發(fā)生和發(fā)展息息相關(guān)，如能夠在動物模型上實現(xiàn)對胰島α細胞的定性、定量分析及對其活性功能進行示蹤，將給α細胞的相關(guān)研究提供強有力的工具。

作為一種新型的脊椎動物模式生物，斑馬魚具有眾多優(yōu)點，特別是可利用熒光蛋白對特定細胞實現(xiàn)可視化的活體示蹤[8-9]。另外，斑馬魚的胰島在解剖學(xué)、形態(tài)學(xué)上以及生理調(diào)控上都和哺乳動物非常相似[10]。更重要的是，斑馬魚在胰島α-細胞和β-細胞發(fā)育過程中關(guān)鍵的信號分子和信號通路都與哺乳動物基本一致，因此斑馬魚是進行糖尿病疾病機理及藥物篩選的良好模式動物[11-13]。

雖然目前，已經(jīng)有胰島α細胞表達的GFP轉(zhuǎn)基因魚Tg(gcga：GFP)[14]，但由于其全細胞表達GFP，在活體分析其細胞功能時，分辨率不高，容易造成數(shù)據(jù)的偏差；且其不能同其他表達GFP的轉(zhuǎn)基因魚進行雙熒光分析，造成了其局限性。因此，為了獲得高分辨率和提供更多分析斑馬魚胰島α細胞的工具，本文構(gòu)建了胰島α細胞細胞核特異表達mCherry的新型轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(-2.8gcga：H2bmCherry)。

1 實驗材料

1.1 儀器 Eps 200電泳儀(Tanon公司)；超凈臺(香港力康生物醫(yī)療科技有限公司)；微波爐(西門子電器有限公司)；水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；魚卵培養(yǎng)箱(韶光市泰宏器械有限公司)；細菌培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；電子天平(舜宇恒平儀器)；M165FC體式熒光顯微鏡(萊卡公司)；Axio Imager AI正置熒光顯微鏡(蔡司公司)；SP8共聚焦顯微鏡(萊卡公司)；小型離心機(Kylin Bell公司)；PCR儀(德國Eppendorf公司)；UPV凝膠成像儀(上海復(fù)日科技有限公司)。

1.2 實驗試劑 DNA高保真聚合酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號：AP131-11)；限制性核酸內(nèi)切酶：Age-I、Kpn-I(NEB 公司)； In-Fusion HD Cloning Kit(Takara公司)；膠紅(Gel stain，上海翊圣生物科技有限公司)；膠回收試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司，批號：B515103-0100]；DNA Marker(Tarkara公司)；多聚甲醛[PFA paraformaldehyde，生工生物工程(上海)股份有限公司，批號：D606BA0003]；瓊脂糖[生工生物工程(上海)股份有限公司，批號：A501004]；小鼠單克隆 antiglucagon抗體(Sigma公司，批號：MABN238)；FITC標記親和純化山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗(Jackson公司，批號：115-095-003)。

1.3 實驗動物 野生型斑馬魚(AB)；Tg(gcga：GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚；Tg(-2.8gcga：H2bmCherry)轉(zhuǎn)基因斑馬魚。條件及產(chǎn)卵方式按照以下實驗方法進行。

2 實驗方法

2.1 實驗動物-斑馬魚的養(yǎng)殖 斑馬魚的飼養(yǎng)是按照標準的飼養(yǎng)方法：每天3次投喂顆粒飼料，早晚各喂養(yǎng)1次豐年蟲卵，并給予適宜的光照(光照 ∶黑暗＝14∶10)和溫度(25℃)，并利用堿泵和鹽泵調(diào)節(jié)適宜的pH(pH為7左右)和電導(dǎo)率(電導(dǎo)率為500左右)進行培養(yǎng)。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 本實驗使用In-fusion試劑盒(Clontech，貨號：638912)進行重組質(zhì)粒pIBS-2.8 gcga：H2bmcherry的構(gòu)建。首先，利用限制性核酸內(nèi)切酶(Age-I和Kpn-I)對實驗室已有質(zhì)粒(pIBS-2.8gcga：H2beGFP，未發(fā)表)進行酶切，膠回收后獲得含有斑馬魚胰高血糖素啟動子的線性化載體。然后，設(shè)計引物 H2b-F1：5′-GGAAGACTCAGCTGACCGGTATGCCAGAGCCAGCGAAGTCT-3和H2b-R1：5′-GAACAAAAGCTGGGTACCAAAAA ACCTCCCACACCTCCCCCTG-3′，正向引物添加了Age-I酶切位點，反向引物添加了Kpn-I酶切位點。利用這對引物，用高保真酶進行PCR擴增的方法從實驗室已有質(zhì)粒p-1.2Ins：H2Bmcherry獲得 H2bmcherry-SV40polyA片段，擴增的條件為：94℃ 30 sec、60℃30 sec、72 ℃ 90 sec，35個循環(huán)。

最后，將線性化載體與目的片段按一定比例混勻，加入2μL In-Fusion HD Enzyme Premix并用水補至10μL，50℃孵育15 min后取5μL加入50μL感受態(tài)(DH5α)內(nèi)做轉(zhuǎn)化，菌落PCR后挑取陽性單克隆，用生工質(zhì)粒小提試劑盒(批號：B515103-0100)抽提質(zhì)粒。質(zhì)粒進行測序并用EcoR-I和Kpn-I進行酶切驗證。經(jīng)過比對后，質(zhì)粒的測序結(jié)果和酶切片段大小與預(yù)期結(jié)果一致，因此判斷該重組質(zhì)粒構(gòu)建完成。

2.3 顯微注射及轉(zhuǎn)基因品系的篩選 野生型斑馬魚(AB)按一雄兩雌的比例提前一晚放至配魚盒內(nèi)并用隔板將雌雄分開。顯微注射前拔出隔板，使其自由交配產(chǎn)卵。先前抽提的質(zhì)粒用生工SanPrep核酸純化套件(批號：B515104-0100)進行純化。然后，按照 I-SceI(R0694S，NEB)0.2 units·μL-1；DNA：50 ng·μL-1；1×NEB buffer2：0.5×的比例將重組質(zhì)粒配制成顯微注射體系，于1-細胞期注入斑馬魚胚胎的細胞質(zhì)中。注射后的胚胎置于恒溫培養(yǎng)箱孵育5 d，后經(jīng)體視熒光顯微鏡下挑選胰島處有紅色熒光的個體(F0代)。3個月后將性成熟的F0代與AB系的斑馬魚進行雜交，然后進行熒光篩選，挑出能夠穩(wěn)定表達轉(zhuǎn)基因特性的幼魚(F1代)，待F1代性成熟后，便可進行后續(xù)實驗。

2.4 斑馬魚幼魚胰島成像及免疫熒光染色 斑馬魚幼魚胰島成像：受精后5 d的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(-2.8gcga：H2bmCherry)幼魚在4℃條件下用4%多聚甲醛(PFA)中固定過夜，然后將其排列于載玻片上并用蓋玻片將幼魚身體壓扁，以便暴露出胰島部分。本實驗成像胰島采用的是Leica SP8倒置共聚焦顯微鏡，所有照片均在63×物鏡下拍攝。后期處理軟件為Image J和Photoshop。

免疫熒光染色：轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(-2.8gcga：H2bmCherry)幼魚的免疫熒光染色參照已有的方法進行[15]。一抗小鼠單克隆anti-glucagon抗體(批號：MABN238，Sigma公司)稀釋比例為 1 ∶1 000，F(xiàn)ITC標記親和純化山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗稀釋比例為1∶5 000。

3 實驗結(jié)果

3.1 轉(zhuǎn)基因表達載體的構(gòu)建 該轉(zhuǎn)基因表達載體pIBS-2.8gcga：H2bmCherry的構(gòu)建過程及結(jié)構(gòu)見(見圖1)。首先，利用限制性核酸內(nèi)切酶Age-I和Kpn-I對質(zhì)粒pIBS-2.8gcga：H2beGFP進行酶切，以除去H2beGFP-SV40polyA片段獲得含有胰高血糖素啟動子的線性化載體pIBS-2.8gcga。酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳可以看到大小分別為5 728 bp(pIBS-2.8gcga)和1 380 bp的兩個條帶，由于跑膠的原因，條帶有略微上移(見圖2A)。與此同時，利用上述引物H2b-F1和H2b-R1，以質(zhì)粒 p-1.2Ins：H2bmCherry為模板，PCR擴增獲得 H2bmCherry-SV40polyA片段，PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳后可以看到大小為1 355 bp單一的目的條帶(見圖2A)。分別膠回收上述5 728 bp和1 355 bp目的條帶后，利用In-fusion試劑盒對獲得的H2bmCherry-SV40polyA片段和pIBS-2.8gcga載體進行重組，并獲得pIBS-2.8gcga：H2bmCherry質(zhì)粒。獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)Kpn-I和EcoR-I酶切和瓊脂糖凝膠電泳，可見5 922 bp和1 125 bp的兩條條帶，與預(yù)期一致(見圖2B)。最后我們通過測序再次驗證了我們獲得的pIBS-2.8gcga：H2bmCherry質(zhì)粒的正確性，因此我們成功構(gòu)建了該載體(見圖2C)。

3.2 轉(zhuǎn)基因斑馬魚系的建立 我們先提取并純化了pIBS-2.8gcga：H2bmCherry質(zhì)粒。因該質(zhì)粒含有歸位內(nèi)切酶(Meganucleases)I-SceI的識別位點，我們配制含有pIBS-2.8gcga：H2bmCherry質(zhì)粒和 ISceI內(nèi)切酶的混合溶液注射至野生型斑馬魚(AB)1-細胞期胚胎的細胞中，經(jīng)過I-SceI的切割和重組將-2.8gcga：H2bmCherry隨機整合到斑馬魚染色體中。胚胎在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 5 d后，利用 Leica M165FC體式熒光顯微鏡進行篩選，挑出胰島處有表達有mCherry紅色熒光的轉(zhuǎn)基因幼苗，置于斑馬魚培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)至性成熟(F0代)。然后將F0代與野生型斑馬魚(AB)雜交，所產(chǎn)生的幼魚經(jīng)篩選后，我們獲得了能夠穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg(-2.8gcga：H2Bmcherry)F1代。我們對所獲得的Tg(-2.8gcga：H2BmCherry)斑馬魚進行了共聚焦成像，結(jié)果表明，該品系中，胰島α細胞非常清晰地表達了紅色熒光蛋白mCherry(見圖3A)。同時我們也把我們獲得的品系與現(xiàn)有的Tg(gcga：GFP)進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)我們構(gòu)建胰島α細胞核表達的mCherry清晰度明顯比胰島α細胞全細胞表達GFP高，且不同α細胞間輪廓界限明顯，可很好地對α細胞進行定量和示蹤分析(見圖3)。

3.3 轉(zhuǎn)基因系的鑒定分析 為了進一步檢測我們所獲得的Tg(-2.8gcga：H2BmCherry)轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系其mCherry熒光特異性表達在胰島α細胞中，我們采用了斑馬魚幼魚免疫熒光染色的方法，受精后5 d(5 dpf)的斑馬魚幼魚用胰高血糖素抗體及熒光二抗進行染色。結(jié)果顯示，Tg(-2.8gcga：H2BmCherry)胰島α細胞的紅色熒光位于細胞核中，而胰高血糖素抗體所標記的綠色熒光與胰高血糖素的原位表達一致，主要在細胞質(zhì)中(見圖4A和4B)。圖片合并后，紅色熒光標記的細胞與胰高血糖素抗體所標記的陽性α細胞完全重合，說明我們所構(gòu)建的Tg(-2.8gcga：H2BmCherry)轉(zhuǎn)基因品系能夠正確地使所有斑馬魚胰島α細胞帶上紅色熒光，并真實地反映出α細胞在斑馬魚胰島內(nèi)的分布狀態(tài)(見圖4C)。

4 分析與討論

作為糖尿病研究的重要器官，胰腺的發(fā)育是研究的重點，與哺乳動物一致，斑馬魚的胰腺由兩個分泌室組成。外分泌室由導(dǎo)管和腺泡細胞組成，來自腺泡細胞的分泌酶可以通過導(dǎo)管轉(zhuǎn)運到全身，并參與消化系統(tǒng)。內(nèi)分泌室由胰島組成，而胰島包含了α、β、δ、ε和PP細胞，分別表達分泌胰高血糖素、胰島素、生長抑素、生長素釋放肽和胰多肽[16-17]。斑馬魚胰島的基本組成與人類非常相似，二者在胰島形成機制和信號通路的研究中存在高度的保守性[13]。

雖然之前Argenton實驗室構(gòu)建了胰島α細胞特異表達GFP的轉(zhuǎn)基因魚Tg(gcga：GFP)[14]，但其清晰度不高，給我們擬開展的一些精確實驗分析造成了一定的難度及實驗數(shù)據(jù)的偏差；且其不能同其他表達GFP的轉(zhuǎn)基因魚進行雙熒光分析，造成了其局限性。本文利用胰高血糖素啟動子驅(qū)動組蛋白H2b融合mCherry報告體表達的轉(zhuǎn)基因方法，構(gòu)建了胰高血糖素穩(wěn)定遺傳系轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(-2.8gcga：H2BmCherry)。該品系能清晰地將mCherry特異表達在斑馬魚胰島α細胞細胞核中，其分辨率和細胞間的輪廓比Tg(gcga：GFP)有明顯的提高。我們進一步通過熒光免疫染色分析確認了該品系能準確標記所有的斑馬魚胰島α細胞。至此，我們成功構(gòu)建了胰島α細胞細胞核特異表達mCherry的轉(zhuǎn)基因魚。

研究表明1型糖尿病和2型糖尿病的最終發(fā)病都會引起胰島β-細胞量的減少或者功能損傷，從而降低胰島素的分泌。同時，還伴隨著胰島α-細胞的功能變化和由此而帶來的胰高血糖素升高。在糖尿病中，α-細胞的功能變化和胰高血糖素的升高是除了高血糖、胰島素抵抗之外的又一表現(xiàn)[18]。由于α細胞的功能在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用，因此近年來對于胰島α細胞在血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和糖尿病發(fā)病機制中作用的研究越來越受到關(guān)注[19]。而本研究所成功構(gòu)建的胰島α細胞細胞核表達mCherry轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(-2.8gcga：H2BmCherry)，可利用斑馬魚胚胎透明可視化的優(yōu)勢，對胰島α細胞起源、發(fā)育、分化等情況進行示蹤和定量分析，對于探索胰島α細胞功能的研究提供了一個便捷又直觀的新型遺傳學(xué)動物模型。同時該品系還可以用于相關(guān)的藥物篩選，為糖尿病的藥物開發(fā)開啟更多的可能性。