李強，徐天任，呂暢，戴衍朋

(1.東營市食品藥品檢驗中心，山東東營257091；2.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南250355；3.山東大學，山東 濟南250012；4.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟南 250014)

肥胖癥是一種較為多見的脂質(zhì)代謝紊亂綜合征，它不僅是單純的體重增加，而且與糖尿病、高血壓、血脂異常、癌癥等慢性病有密切關系[1-2]。隨著大眾生活水平的逐漸提高以及生活方式的改變，肥胖癥的發(fā)病率逐年上升，公眾對其關注度也越來越高。因此，如何預防和治療肥胖癥成為當下比較熱門的研究方向。目前，市面上廣泛使用的減肥藥為奧利司他(Orlistat)，這是一種長效的、強效的特異性胃腸道脂肪酶抑制劑，能有效抑制胰脂肪酶(PL)的活性，失活的酶不能將食物中的脂肪(多為甘油三酯)水解為可吸收的甘油單酯及游離脂肪酸，從而起到降糖降脂、減輕體重的目的，改善與肥胖有關的狀態(tài)[3]。然而有相關研究表明，奧利司他可能導致嚴重的肝損害、腎損害，也會引起患者胃腸不良反應，長期使用可致營養(yǎng)不良[4]。因此，從天然藥物中找尋奧利司他的替代品是當前研究的主要目的。

近年來，從天然動植物資源中獲取有顯著活性且毒性較低的多糖用于日常保健治療已成為國內(nèi)外生物大分子領域的研究熱點[5]。山楂為薔薇科植物山里紅(Cralaegus pinnatifida.Bge.var.major N.E.Br.)或山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)的干燥成熟果實[6]，自古藥食兩用，有消食化積，健脾開胃的功效[7]。山楂的藥用價值很高，不僅可以調(diào)節(jié)動物體內(nèi)脂代謝，還可以保護心血管系統(tǒng)、抗氧化、抗腫瘤等[8]。本試驗以山楂為研究對象，旨在探究山楂飲片的水提液在體外對胰脂肪酶活性的抑制作用，為新的具有抗肥胖作用的藥品、保健品開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與儀器

1.1 儀器 Multiskan FC酶標儀(Thermo Scientitic公司)；TGL-16B高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；PHS-3E pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)；渦旋混勻器(廣州艾卡儀器設備有限公司)；DK-S22電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)；96孔板(NEST生物科技有限公司)；移液槍(Eppendorf公司)。

1.2 試劑 山楂(市售樣品24批、自制樣品34批)；對硝基苯基丁酸酯(pNPB，上海甄準生物科技有限公司)；胰脂肪酶(Pancreatic Lipase，PL，合肥博美生物科技有限公司)；奧利司他(Orlistat，上海源葉生物科技有限公司)；磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O，國藥集團)；磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O，天津鼎盛鑫化工有限公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris，合肥博美生物科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO，天津富宇精細化工有限公司)；乙腈(Acetonitrile，西隴化工股份有限公司)，試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 山楂飲片提取液制備 取不同山楂飲片約5.0 g，加50 mL水，加熱回流，沸騰后開始計時，保持微沸，提取30 min，濾過，藥渣加水50 mL，煎煮 30 min，濾過，棄去藥渣，合并濾液，濃縮至50 mL，得到生藥質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1的水提液。

2.1.2 山楂樣品制備 水提液12 000 rpm離心10 min，用 Tris-HCl緩沖液稀釋到質(zhì)量濃度為 50 mg·mL-1，再用DMSO逐級稀釋，得到質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的樣品。

2.1.3 PBS緩沖液制備 準確稱取17.9 g Na2HPO4·12H2O和7.80 g NaH2PO4·2H2O，加入蒸餾水溶解，定容到250 mL，4℃保存?zhèn)溆?。使用時，在pH計標定下，逐漸向Na2HPO4溶液中加入NaH2PO4溶液，最后得濃度為200 mmol·L-1，pH＝7.5的 PBS緩沖液。

2.1.4 Tris-HCl緩沖液制備 準確稱取1.50 g Tris，2.92 g NaCl加入蒸餾水溶解，定容至250 mL，用HCl調(diào)節(jié) pH 為7.5，得濃度為50 mmol·L-1的Tris-HCl緩沖液，于4℃保存。

2.1.5 胰脂肪酶溶液(PL)制備 精密稱取適量胰脂肪酶粉末，用PBS緩沖液配制成質(zhì)量濃度為 1 mg·L-1的粗酶液，4 000 rpm離心5 min，取上清液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1.6 pNPB溶液(底物)配制 用移液槍吸取18 μL pNPB溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，得濃度為10 mmol·L-1的溶液，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.7 奧利司他溶液配制 精密稱取奧利司他標準品粉末0.123 9 g于25 mL容量瓶中，用DMSO定容得1 mmol·L-1的溶液，采用2倍稀釋法用Tris-HCl緩沖液逐級稀釋至10μmol·L-1，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 試驗方法與結(jié)果

2.2.1 最適底物濃度篩選 用乙腈配制不同濃度的對硝基苯酚丁酯底物溶液(pNPB)，取pH 7.5的Tris-HCl緩沖液800μL，酶溶液100μL，于37℃下孵育10 min后，加入配制好的不同濃度的pNPB溶液100μL，于 37℃下反應10 min后，405 nm測定吸光度值，以不添加酶作為其空白對照組，計算酶活，分析底物濃度對酶活力的影響。

由酶底物線性圖可知，底物濃度在 10 mmol·L-1以下時酶活隨著底物濃度的增加活力上升明顯，在10 mmol·L-1出現(xiàn)拐點之后活力基本沒有變化。因此選取10 mmol·L-1作為胰脂肪酶抑制率試驗底物濃度，結(jié)果見圖1。

2.2.2 酶最適pH篩選 分別配制不同pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)的 Tris-HCl緩沖液。 取不同pH 的Tris-HCl緩沖液 800μL，酶溶液100μL，于37℃水浴鍋中孵育10 min后，加入配制好的10 mmol·L-1(pNPB)溶液 100μL，37℃下反應10 min后，405 nm測定吸光度值，以不添加酶作為其空白對照組，計算酶活，分析不同pH對酶活力的影響。

酶活力隨著pH的增高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，為典型的鐘罩型曲線變化，其結(jié)果也與大多數(shù)文獻報道的采用對硝基苯酚酯底物法的最適pH 7.5相同。說明胰脂肪酶在偏堿性的條件下活力較強。因此試驗過程中配制pH 7.5的Tris-HCl緩沖液，結(jié)果見圖2。

2.2.3 酶最適溫度篩選 取pH 7.5的Tris-HCl緩沖液 800 μL，酶溶液100 μL，分別于 25、30、37、40、45℃下孵育10 min后，加入配制好的10 mmol·L-1(pNPB)溶液100μL，再分別于各孵育溫度下反應10 min后，405 nm測定吸光度值，以不添加酶作為其空白對照組，計算酶活，分析不同溫度對酶活力的影響。

酶活力隨著溫度的升高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，胰脂肪酶最適溫度在37℃。國際上通用的測定酶活的溫度為30℃和37℃，而30℃的溫度較低，反應速度較慢，其測定的靈敏度也較為遲緩。因此結(jié)合本試驗結(jié)果，選取37℃作為酶反應溫度，結(jié)果見圖3。

2.2.4 胰脂肪酶抑制率測定方法 在1.5 mL的EP管中加入抑制劑(或Tris-HCl)與酶于37℃下孵育10 min，加入150μL底物，混勻，孵育5 min。取150 μL于96孔板中，于405 nm下測定吸光度。

胰脂肪酶抑制率計算公式為：抑制率(%)＝[1-(B-b)/(A-a)]×100[9-10]，其中，A 為未添加抑制劑酶的活性，a是其空白對照(未加酶)；B是加入抑制劑的酶的活性，b是其陰性對照(未加酶)。

每個試驗重復3次，最終求得所得結(jié)果的平均值。各組加入量如表1所示。

表1 反應體系各組所加試劑及用量

2.2.5 奧利司他胰脂肪酶抑制率測定 精密稱取適量的奧利司他(陽性藥物)加入DMSO溶解后，用配制好的 Tris-HCl稀釋成 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μmol·L-1不同濃度的奧利司他溶液作為胰脂肪酶抑制劑，按照胰脂肪酶抑制率測定方法測定奧利司他對胰脂肪酶的抑制率，運用Graphpad Prism 7.0軟件以抑制劑不同濃度的對數(shù)為X軸，以對胰脂肪酶的抑制率為Y軸進行線性分析，從而計算得其IC50(見圖4)。

不同濃度的奧利司他的抑制率如表2所示，計算得奧利司他 IC50為0.516 1 mg·mL-1。

表2 不同濃度奧利司他抑制率

2.2.6 山楂樣品胰脂肪酶抑制率測定 取14號山楂樣品的供試品液以12 000 rpm離心10 min，用Tris-HCl緩沖液稀釋到50 mg·mL-1，再用 DMSO逐級稀釋到 25、20、10、5、2 mg·mL-1作為胰脂肪酶抑制劑，按照胰脂肪酶抑制率測定方法測定山楂樣品對胰脂肪酶的抑制率，運用Graphpad Prism 7.0軟件以抑制劑不同濃度的對數(shù)為X軸，以對胰脂肪酶的抑制率為Y軸進行線性分析，從而計算得其IC50。

不同濃度的山楂水提液樣品的抑制率如表3所示，計算得山楂水提液樣品的IC50為13.40 mg·mL-1。

表3 不同濃度山楂飲片抑制率

以質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的山楂水提液樣品作為胰脂肪酶抑制劑，測得各樣品抑制率如表4所示。

由表4可知，不同產(chǎn)地、不同批次山楂均具有一定胰脂肪酶抑制活性，24批山楂對胰脂肪酶的抑制率均值為38.69%±7.79%，中值為39.57%，抑制率在26.08%～49.73%之間。16批山東青州產(chǎn)的山楂樣品中，抑制率均值為 40.48%±7.82%，中值為42.61%，抑制率在26.08%～49.73%之間。

3 討論與總結(jié)

胰脂肪酶由胰腺分泌，是食物脂肪水解過程中的主要酶類，負責代謝 50%～70% 的甘油三酯，抑制其活性可有效抑制脂肪的水解和吸收，以達到控制和治療肥胖的目的[11-13]。奧利司他(Orlistat)是一種專一強效的胃腸道胰脂肪酶抑制劑，其主要通過抑制胰脂肪酶的活性，減少人體內(nèi)脂肪的吸收，改善胰島素抵抗，從而發(fā)揮減重效果[14-15]。本試驗以奧利司他標準品作為陽性藥物，旨在考察以對硝基苯基丁酸酯作為底物的抑制率測定方法是否合理，是否真實可行。結(jié)果表明，奧利司他對胰脂肪酶的活性有顯著的抑制作用。

表4 市售山楂飲片胰脂肪酶抑制率(n＝3)

在所收集的不同產(chǎn)地不同批次山楂樣品中，產(chǎn)地為山東青州的共有16批，結(jié)果表明，同一產(chǎn)地的山楂其抑制活性也有較大差異；青州產(chǎn)地的平均抑制率為40.5%，而其他產(chǎn)地抑制率平均為35.1%。

青州產(chǎn)地的山楂樣品中，2016年批次的平均抑制率為(48.3%±2.2%)，2017年批次的平均抑制率為(45.3%±3.2%)，2018年批次的平均抑制率為(35.6%±8.1%)，2019年批次的平均抑制率為(41.3%±4.6%)，由此可知，山楂對胰脂肪酶的抑制率并未隨貯存時間的延長而降低，表明山楂中對胰脂肪酶具有抑制作用的成分可能具有較高的穩(wěn)定性。

青州產(chǎn)地的一級品、二級品、三級品山楂，對胰脂肪酶的抑制率分別為46.37%、40.15%、37.31%，表明山楂對胰脂肪酶的抑制作用與其飲片的等級具有正相關關系，提示該指標可作為山楂飲片劃分的生物效應指標。

不同批次、不同產(chǎn)地的山楂樣品，抗胰脂肪酶的活性具有顯著差異，在進一步的研究中，應進一步深入研究其中的主要活性部位或成分，為山楂的綜合利用以及新的抗肥胖藥物的研究提供數(shù)據(jù)支撐。