王淑靜，訾慶雪，付玉，劉琳，張文君，張家寧

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076)

肺癌是一種臨床上常見的呼吸系統(tǒng)的惡性疾病，在我國(guó)腫瘤的發(fā)病率和死亡率中均居前列，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)患者的生命安全造成了嚴(yán)重威脅[1-2]。目前，肺癌的化療主要采用鉑類藥物，如順鉑或卡鉑，但多次使用后會(huì)出現(xiàn)耐藥性，并且患者化療后生活質(zhì)量較差[2]。因此，尋找行之有效的藥物及治療途徑對(duì)肺癌治療至關(guān)重要。

雷公藤紅素(celastrol)是衛(wèi)矛科植物雷公藤的主要活性成分之一，為醌甲基型五環(huán)三萜類化合物，分子式為C29H38O[3-4]，雷公藤紅素具有抗腫瘤、抗炎與抑制免疫、抑制血管生成、抗神經(jīng)退行性疾病、抗病毒、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理活性[5-7]。研究表明，雷公藤紅素具有良好的抗腫瘤活性，本文選取人肺癌細(xì)胞A549，從能量代謝的角度研究雷公藤紅素對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制和促凋亡的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

1.1.1 主要材料 人肺癌細(xì)胞株(A549)，哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院保存；雷公藤紅素(純度≥99.5%)，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院成都研究所；RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶，購(gòu)于Invitrogen公司；己糖激酶試劑盒、丙酮酸激酶試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒、琥珀酸脫氫酶試劑盒及ATP含量測(cè)定試劑盒，購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.1.2 主要儀器 MR-96A酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療股份有限公司；Mco-15AC CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自日本Sanyo El公司；3K30低溫離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CKX 41SF倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞株(A549)在含有10%胎牛血清及1%青鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，PBS漂洗，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL。取96孔板，四周鋪100μL PBS，其余孔加細(xì)胞懸液100 μL，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄原培養(yǎng)液，各孔加由無(wú)血清的1640培養(yǎng)液配置雷公藤紅素，濃度梯度為 1.5、2、2.5、3、3.5、4 μg·mL-1，陽(yáng)性對(duì)照組加5-FU(10μg·mL-1)，空白對(duì)照組加等體積無(wú)血清培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。 每孔加10μL MTT(5 μg·mL-1)培養(yǎng) 4 h，棄原液，每孔加150μL DMSO。490 nm酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值。計(jì)算細(xì)胞抑制率及IC50。

1.4 生長(zhǎng)曲線 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，PBS漂洗，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，取24孔板每孔加400μL細(xì)胞懸液，37℃培養(yǎng)24 h。棄原培養(yǎng)液，雷公藤紅素組、空白對(duì)照組分別加入400μL雷公藤紅素(終濃度為3μg·mL-1)和無(wú)血清培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。臺(tái)盼藍(lán)(0.04%)溶液染色，光鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)。每天取3個(gè)孔，每孔計(jì)數(shù)3次，求平均值，以活細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線圖。

1.5 HE染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，胰酶消化制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，接種于帶有蓋玻片的6孔板中，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h，吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入400μL雷公藤紅素(終濃度為3μg·mL-1)，空白組加入400μL無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄原液，取出蓋玻片，依次使用蘇木精染液和伊紅染液染色，37℃培養(yǎng)箱中干燥24 h后顯微鏡下觀察，具體方法參照文獻(xiàn)[8]。

1.6 能量代謝相關(guān)酶活力及代謝產(chǎn)物含量測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，PBS漂洗，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，取 接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分組及給藥濃度同“1.5”項(xiàng)下，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。經(jīng)胰酶消化后吹打成細(xì)胞懸液，2 000 rpm離心5 min，棄上清。加0.9%生理鹽水重懸、離心，重復(fù)操作兩次。一般樣品處理將細(xì)胞懸液加入石英細(xì)胞勻漿器中，0℃手動(dòng)勻漿6～8次，每次勻漿1 min，間隔30 s。ATP樣品處理將細(xì)胞懸液(不少于106個(gè))加入300μL熱雙蒸水中，沸水浴中破碎后繼續(xù)加熱10 min。BCA法測(cè)定各組樣品蛋白濃度。根據(jù)試劑盒測(cè)定HK、PK、LDH和SDH的活力以及ATP含量，具體操作見試劑盒說(shuō)明書和文獻(xiàn)[8]。

1.7 統(tǒng)計(jì)與分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，結(jié)果均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用完全隨機(jī)分組設(shè)計(jì)的多樣本均數(shù)比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤紅素的濃度選擇 實(shí)驗(yàn)測(cè)得，10 μg·mL-1的5-FU對(duì)A549的抑制率為48.84%。由表1可知，雷公藤紅素對(duì)A549的抑制作用較強(qiáng)，當(dāng)雷公藤紅素的濃度在2μg·mL-1時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞的抑制率達(dá)到62.71%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于陽(yáng)性藥組5-FU，當(dāng)雷公藤紅素濃度大于2μg·mL-1時(shí)，抑制率無(wú)明顯差異，結(jié)合前期的其他細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，選用3μg·mL-1的雷公藤紅素濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥濃度。

表1 雷公藤紅素對(duì)A549增殖活性影響

2.2 生長(zhǎng)曲線法檢測(cè)細(xì)胞增殖 如圖1所示，對(duì)照組A549細(xì)胞隨時(shí)間增加，細(xì)胞濃度升高，在第6天濃度最高，與對(duì)照組比較，雷公藤紅素作用24 h細(xì)胞濃度降低，隨著雷公藤紅素作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制作用明顯，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，在第4天細(xì)胞濃度最低，第6天細(xì)胞抑制程度最明顯。

2.3 HE染色法觀察細(xì)胞形態(tài) 如圖2所示，在40×鏡下觀察，對(duì)照組A549細(xì)胞形態(tài)為梭形，而雷公藤紅素組A549細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，主要體現(xiàn)為細(xì)胞邊緣變亮、形態(tài)變圓、體積減小、核深染、胞質(zhì)凝集且顏色變深。

2.4 酶活力及ATP含量測(cè)定 己糖激酶、丙酮酸激酶是糖酵解中兩個(gè)重要的關(guān)鍵酶，乳酸脫氫酶可將丙酮酸轉(zhuǎn)化為糖酵解的終產(chǎn)物乳酸，決定細(xì)胞的酸性環(huán)境，雷公藤紅素組與對(duì)照組相比，乳酸脫氫酶活力顯著下降(P＜0.01)，對(duì)于己糖激酶和丙酮酸激酶活力來(lái)說(shuō)，雷公藤紅素組與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，說(shuō)明雷公藤紅素對(duì)己糖激酶和丙酮酸激酶作用不敏感，影響較??；對(duì)于三羧酸循環(huán)的標(biāo)志酶琥珀酸脫氫酶活力來(lái)說(shuō)，雷公藤紅素組顯著下降(P＜0.05)。從總體ATP含量來(lái)說(shuō)，對(duì)照組和雷公藤紅素組細(xì)胞內(nèi)每克蛋白中ATP含量分別為2 438.03 μmol、1 065.43 μmol，雷公藤紅素組 ATP含量顯著降低(P＜0.05)。因此雷公藤紅素能夠抑制糖酵解中的乳酸脫氫酶和三羧酸循環(huán)中的琥珀酸脫氫酶活力，進(jìn)而減少ATP生成。

表2 雷公藤紅素對(duì)A549細(xì)胞HK、PK、LDH以及SDH活力的影響(U·g-1)

3 討論

腫瘤是危害人類健康的主要疾病，越來(lái)越多的研究表明許多天然中藥活性成分由于其易合成、毒副作用低、療效穩(wěn)定等特點(diǎn)，有望成為未來(lái)理想的抗腫瘤藥物[9]。雷公藤紅素能通過(guò)抑制蛋白酶體活性而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，也有強(qiáng)抗氧化作用和抗腫瘤血管生成作用[10]。本實(shí)驗(yàn)使用雷公藤紅素處理人肺癌A549細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡情況、能量代謝相關(guān)酶活力和代謝產(chǎn)物含量，來(lái)探究雷公藤紅素對(duì)A549肺癌細(xì)胞的增殖抑制和相關(guān)機(jī)制。

MTT結(jié)果顯示，雷公藤紅素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549具有增殖抑制作用。當(dāng)雷公藤紅素的濃度為2 μg·mL-1時(shí)，抑制率達(dá)到62.71%，高于陽(yáng)性藥5-FU(10μg·mL-1)的48.84%，認(rèn)為雷公藤紅素具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。但是當(dāng)濃度大于2μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞抑制率影響很小，各濃度之間抑制率無(wú)明顯變化，結(jié)合前期對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞HUEVC、胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，確定最終的給藥濃度為3 μg·mL-1。生長(zhǎng)曲線連續(xù)6 d觀察雷公藤紅素對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞濃度降低，具有時(shí)間依賴性，在第1天細(xì)胞數(shù)量開始下降，在第4天細(xì)胞濃度最低，在第6天抑制程度最明顯。HE染色結(jié)果表明，藥物處理后細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，體現(xiàn)為細(xì)胞變圓、體積變小、胞質(zhì)凝縮等，說(shuō)明雷公藤紅素對(duì)A549細(xì)胞的增殖能夠發(fā)揮抑制作用。以上3種實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示雷公藤紅素抑制人肺癌細(xì)胞A549的增殖作用明顯。

腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖旺盛，與普通細(xì)胞相比，所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的量更多。糖酵解和氧化磷酸化是細(xì)胞進(jìn)行能量代謝的主要途徑，對(duì)于普通細(xì)胞來(lái)說(shuō)，當(dāng)氧氣充足時(shí)，葡萄糖經(jīng)徹底氧化產(chǎn)生32分子的ATP；當(dāng)氧氣供應(yīng)不足時(shí)，僅通過(guò)糖酵解產(chǎn)生2分子的ATP，因此只有在缺氧的條件下，正常細(xì)胞才會(huì)使用這種低產(chǎn)能的方式進(jìn)行能量供應(yīng)。但是在1923年，Warburg博士提出，與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞內(nèi)葡萄糖攝取和糖酵解速率顯著增加。高速糖酵解快速產(chǎn)生ATP，并且不再偶聯(lián)線粒體氧化代謝，產(chǎn)生的丙酮酸大多數(shù)由乳酸脫氫酶催化，在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中轉(zhuǎn)化為乳酸。即使在氧氣充足支持線粒體呼吸的情況下，腫瘤細(xì)胞仍青睞糖酵解作為主要的產(chǎn)能途徑[11]。因此，腫瘤細(xì)胞常出現(xiàn)葡萄糖攝取量增高、糖酵解增加和乳酸堆積等現(xiàn)象。乳酸脫氫酶催化丙酮酸生成糖酵解的終產(chǎn)物乳酸，不僅為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供有利的酸性微環(huán)境，也與腫瘤耐藥性密切相關(guān)[12]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雷公藤紅素對(duì)細(xì)胞內(nèi)的LDH的活力有抑制作用，抑制丙酮酸轉(zhuǎn)化成乳酸，可能會(huì)破壞腫瘤的酸性微環(huán)境。琥珀酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，也是線粒體的標(biāo)志酶，主要催化琥珀酸生成延胡索酸并伴有能量的生成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雷公藤紅素對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)的SDH活性有顯著的抑制作用，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞A549內(nèi)的氧化磷酸化過(guò)程產(chǎn)生影響。但是雷公藤紅素對(duì)HK和PK活力無(wú)明顯影響。ATP是最主要的供能物質(zhì)，腫瘤的增殖侵襲等生理活動(dòng)離不開ATP。雷公藤紅素組中的ATP含量明顯下降，推測(cè)雷公藤紅素可能通過(guò)干預(yù)能量生成，進(jìn)而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的作用。

綜上所述，雷公藤紅素可能通過(guò)影響糖酵解和氧化磷酸化過(guò)程中的酶活力，導(dǎo)致ATP合成減少，從而干擾腫瘤細(xì)胞能量代謝，發(fā)揮對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制作用。