楊得志 潘運迎 覃興善 陳柳紅 黃曙院

【摘要】 目的：探討程序死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）和基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）在結直腸癌的表達及其臨床意義。方法：收集2015年3月-2019年3月本院行根治手術治療的結直腸癌患者86例的癌組織及癌旁組織標本，運用免疫組織化學方法檢測癌組織及癌旁組織MMP2和PD-L1蛋白的表達水平，分析MMP2和PD-L1蛋白表達與結直腸癌臨床病理學特征的關系。結果：MMP2和PD-L1蛋白均表達于目標細胞的細胞質和細胞膜。結直腸癌組織中MMP2和PD-L1蛋白表達陽性率均明顯高于癌旁組織（P<0.05）。不同分化程度與pTNM分期的結直腸癌組織MMP2與PD-L1蛋白陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;且不同腫瘤最大徑和CEA表達情況的結直腸癌組織MMP2蛋白陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。PD-L1和MMP2蛋白的陽性表達與結直腸癌具有相關性（rs=0.246，P=0.028）。結論：PD-L1和MMP2蛋白表達與結直腸癌組織具有相關性，其高表達率可能與結直腸癌發(fā)生發(fā)展有關。

【關鍵詞】 結直腸癌 細胞程序死亡配體1 基質金屬蛋白酶-2

Expressions of PD-L1 and MMP2 in Colorectal Cancer and Its Clinical Significances/YANG Dezhi， PAN Yunying， QIN Xingshan， CHEN Liuhong， HUANG Shuyuan. //Medical Innovation of China， 2020， 17（13）： 019-023

[Abstract] Objective： To investigate the expression of programmed death ligand 1 （PD-L1） and matrix metalloproteinase 2 （MMP2） in colorectal cancer and its clinical significance. Method： Cancer tissue and tissue adjacent to the tumour specimens were collected from 86 patients with colorectal cancer underwent radical surgical treatment in our hospital from March 2015 to March 2019. The expression of MMP2 and PD-L1 protein in cancer tissues and paracancer tissues were detected by immunohistochemistry. The relationship between the expression of MMP2 and PD-L1 and the clinicopathological characteristics of colorectal cancer were analyzed. Result： MMP2 and PD-L1 were expressed in the cytoplasm and membrane of the target cell. The positive rates of MMP2 and PD-L1 protein expression in colorectal cancer tissue were significantly higher than those in tissue adjacent to the tumour （P<0.05）. The positive expression rates of MMP2 and PD-L1 proteins in colorectal cancer tissues with different differentiation degrees and pTNM stages were compared， the differences were statistically significant （P<0.05）. And the positive expression rate of MMP2 protein in colorectal cancer tissues with different tumor maximum diametral and CEA expression were compared， the differences were statistically significant （P<0.05）. The positive expression of PD-L1 and MMP2 were correlated with colorectal cancer （rs=0.246， P=0.028）. Conclusion： The expression of PD-L1 and MMP2 proteins is correlated with colorectal cancer tissues， and the high expression rate may be related to the development of colorectal cancer.

[Key words] Coloretcal cancer Programmed death ligand 1 Matrix metalloproteinase-2

First-authors address： Traditional Chinese Medical Hospital of Liuzhou， Liuzhou 545001， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.13.005

隨著生活習慣方式等因素的改變，結直腸癌已經(jīng)成為危害我國人民生命健康的主要腫瘤之一。然而特別令人遺憾的是結直腸癌的預后一直不佳，因此全國的相關研究人員長期從多方面努力尋求突破。值得關注的是近年來有科學家證實人體的免疫反應在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程及多種治療方式的反應中都具有至關重要的意義[1-2]。正常生理情況下，人體通過免疫負反饋方式調控炎癥的合理反應程度，避免過度反應，從而達到保持健康的狀態(tài);而在病理情況下，狡猾的腫瘤細胞則能夠通過模擬這些負反饋調控通路上的重要分子或促進機體表達這些重要分子來逃避免疫監(jiān)視，從而促進腫瘤的生存和發(fā)展[3]。Bertucci等[4]研究表明，PD-L1在乳腺癌等多種腫瘤組織和免疫細胞中均可高表達。PD-L1可以通過與其配體PD-1相結合而發(fā)生作用，即形成所謂的PD-1/PD-L1調節(jié)通路。該通路能夠通過調節(jié)T和B淋巴細胞的活化與增殖，來抑制免疫系統(tǒng)對腫瘤的攻擊，即所謂的腫瘤免疫逃逸[5]。在機體中，阻斷PD-1/PD-L1通路可恢復或增強T淋巴細胞功能，從而使腫瘤細胞被發(fā)現(xiàn)和被攻擊，保持甚至增強機體正常的免疫監(jiān)視和防御功能[6]。但是，PD-1/PD-L1通路具體通過何種下游通路的級聯(lián)效應來實施腫瘤免疫逃逸功能尚不十分清楚。因此本研究期望通過檢測結直腸癌和癌旁組織中PD-L1與MMP2蛋白表達情況，分析此兩種蛋白陽性表達率與結直腸癌臨床病理學特征之間是否具有相關性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 收集2015年3月-2019年3月于本院行根治手術治療的86例結直腸腺癌患者的癌組織和癌旁組織標本。納入標準：術前未接受化療和放療，術后常規(guī)組織病理學確診為結直腸腺癌。排除標準：臨床病理相關基本信息不完整者。其中男50例，女36例;年齡28歲～79歲，平均（62±12）歲，其中<60歲35例，≥60歲51例;腫瘤發(fā)生部位：結腸42例，直腸44例;腫瘤最大徑：<5.0 cm 56例，≥5.0 cm 30例;組織學分化程度：高分化12例，中分化25例，低分化49例;pTNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期27例，Ⅲ期29例，Ⅳ期20例;淋巴結轉移：有轉移31例，無轉移

55例;常見腫瘤標志物血生化檢測：癌胚抗原（CEA）陽性40例，陰性46例;糖類抗原19-9（CA19-9）陽性15例，陰性71例。以上所有病理材料送檢之前已與患者或代理人簽訂送檢組織滿足診斷后允許進行科研的同意書，并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會批準通過。

1.2 主要實驗試劑 MMP2鼠抗人單克隆抗體（克隆號：Clone OTI4A11，貨號：TA806846）、PD-L1鼠抗人單克隆抗體（克隆號：MRQ-22，貨號：ZM-0381）和免疫組織化學二抗（SP法）試劑盒均購自中杉金橋（北京）生物公司。

1.3 方法 檢測MMP2和PD-L1蛋白的表達。實驗操作過程按免疫組織化學試劑盒說明書進行并且設立了標準的外部對照：常規(guī)制作4 μm厚石蠟切片，然后烤片脫蠟至水并抗原修復后，再滴加一抗冰箱孵育過夜，最后鏡下觀察滴加DAB顯色、蘇木素復染和封片。

1.4 判定標準 所有切片結果的判定由兩位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師采用雙盲法進行觀察評估。PD-L1蛋白以細胞漿/質出現(xiàn)黃色或者棕色顆粒者為蛋白表達陽性，并結合陽性細胞所占比例，采用半定量積分法綜合判定。（1）根據(jù)目標細胞的顯色強度計分：無染色者記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。（2）目標細胞的占比：25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，≥76%記4分。PD-L1蛋白染色結果判斷標準：目標細胞的染色強度和占比兩項積分相乘，其中0～2分為表達陰性，≥3分為表達陽性[7]。MMP2蛋白以細胞膜和/或細胞漿成棕黃色或者黃褐色者染色為陽性染色細胞，然后高倍鏡（200×）下評估陽性腫瘤細胞的面積與整張切片中腫瘤面積的比例，≥10%者為陽性，<10%者為陰性[8]。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗;MMP2和PD-L1蛋白表達與結直腸癌組織的相關性分析采用Spearman秩相關性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MMP2和PD-L1蛋白的陽性表達情況 MMP2

和PD-L1蛋白的免疫組織化學染色結果顯示，兩種蛋白均表達于目標細胞質和細胞膜，見圖1。癌組織中MMP2和PD-L1蛋白表達陽性率均明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001），見表1。

2.2 結直腸癌組織中MMP2與PD-L1蛋白陽性表達與臨床病理學特征的關系 不同分化程度與pTNM分期的結直腸癌組織MMP2與PD-L1蛋白陽性表達率比較，不同腫瘤最大徑和CEA表達情況的結直腸癌組織MMP2蛋白陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 MMP2和PD-L1蛋白在結直腸癌組織中表達的相關性分析 PD-L1和MMP2蛋白在結直腸癌組織中同時表達陽性為43例。PD-L1和MMP2蛋白的陽性表達與結直腸癌具有相關性（rs=0.246，P=0.028）。

3 討論

隨著腫瘤治療的三大傳統(tǒng)治療方式（手術、放療、化療）技術水平的不斷提高，患者的生存獲益也得到了極大的提升，但是目前的治療似乎也到達了一個新的“天花板”。值得期待的是近年來臨床在腫瘤免疫治療方面有了不小的新進展，特別是針對免疫檢查點設計抑制劑的相關研究正迅速成為一種治療惡性腫瘤極具前途的新方法[9]。有科研工作者已經(jīng)證實能夠通過抑制免疫檢查點來恢復人體對腫瘤組織的免疫應答，從而有效的控制腫瘤[10]。運用相關原理和方法雖然在對晚期腫瘤的治療方面獲得了不小的突破，但是治療的總體有效率仍然比較低[11]。例如在晚期腎癌治療方面，有研究顯示，針對PD-1/PD-L1通路的免疫檢查點所設計的抑制劑，其有效率僅為25%[12]。但如果同時聯(lián)合應用其他傳統(tǒng)治療藥物則可提高治療的有效率，這也反映了腫瘤免疫逃逸機制的復雜性[13]。因此，任何探究結直腸癌免疫監(jiān)視與逃逸機制相關的研究均有可能為最終改善治療甚至攻克該腫瘤做出貢獻。

PD-L1（亦稱為B7-H1）是由中國學者于1999年率先報道[13]。PD-1包括PD-L1和PD-L2兩種配體，其中PD-L1主要參與腫瘤的免疫調節(jié)方面。腫瘤組織自身能夠產(chǎn)生PD-L1蛋白，該蛋白能與其在T淋巴細胞上的PD-1配體相結合，來引起T淋巴細胞對腫瘤的免疫監(jiān)視功能障礙而不清除腫瘤，最終達到保護自身免受影響，實現(xiàn)免疫逃逸[14]。新近研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在包括非小細胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、腎癌等多種腫瘤中均可高表達，且其表達水平的高低有助于判斷腫瘤的侵襲和轉移等生物學行為，同時也可作為判斷預后的重要參考依據(jù)[15]。Uruga等[16]在關于肺腺癌淋巴結轉移的研究中發(fā)現(xiàn)，PD-L1蛋白高表達與腫瘤的高pTNM分期、腫瘤的組織學類型、脈管侵犯等臨床病理學特征密切相關，與本研究結果相似。本研究中，PD-L1雖然在結直腸癌及癌旁組織中均有表達，但癌組織中PD-L1蛋白陽性表達率為53.49%明顯高于癌旁組織的22.09%（P<0.05），這提示PD-L1可能在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起著重要作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達陽性率與結直腸癌的分化程度和pTNM分期有關，即隨著分化程度降低或pTNM分期升高PD-L1蛋白表達的陽性率反而越高，這亦提示PD-L1可能在結直腸癌的進展過程中也起著重要作用?？傊?，PD-L1蛋白結直腸癌組織中表達水平的高低可能幫助醫(yī)生判斷預后。

MMP2（又名明膠酶A）目前已被很多學者證實在腫瘤組織中高表達，并且其在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Han等[17]研究表明MMP2的表達水平與結腸癌的組織學分級和pTNM分期具有相關性。還有學者研究發(fā)現(xiàn)，IL-17A可能通過激活PI3K/AKT/NF-κB轉導通路來調節(jié)MMP2蛋白的表達，從而誘導結腸癌SW480細胞遷移和侵襲力的提高[18]。

本研究也有類似的發(fā)現(xiàn)，在結直腸癌組織中MMP2蛋白陽性表達率為73.25%高于癌旁組織的陽性表達率的30.23%（P<0.05），并且MMP2蛋白表達的陽性率與結直腸癌的組織學分化程度、pTNM分期、腫瘤最大徑及CEA血生化陽性均具有相關性，這提示MMP2蛋白陽性表達率可能與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展等生物學行為密切相關。本研究結果顯示，PD-L1和MMP2蛋白陽性表達與結直腸癌組織具有相關性（rs=0.246，P=0.028），且兩者陽性表達率均與腫瘤的分化程度和pTNM分期密切相關。這提示PD-L1和MMP2可能在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在協(xié)同作用。此外已有研究發(fā)現(xiàn)PD-L1與PD-1結合激活PI3K/AKT通路，亦有研究提示MMP2可被PI3K/AKT通路調控[19-20]。這些研究結果和本研究結果均提示，PD-L1可能通過PI3K/AKT通路和MMP2蛋白等因子發(fā)生相互作用來共同影響結直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，PD-L1和MMP2蛋白在結直腸癌組織中的異常高表達提示它們可能與結直腸癌的生長、侵襲、轉移等密切相關。但是，它們之間的具體相互作用機制還有待進一步深入探究，也許在不久的將來在該通路上的一些重要因子會成為結直腸癌免疫治療方面的新靶點也尚未可知。

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（收稿日期：2019-08-28） （本文編輯：田婧）