陳炎城 何丹 曾運泉

【摘要】 目的：探討T-SPOT.TB、ADA、TBDNA對結核性胸膜炎的診斷價值。方法：選取本院2016年8月-2019年3月收治的30例結核性胸膜炎患者納入結核性胸膜炎組，25例癌性胸腔積液、2例肺炎性胸腔積液、2例膿胸納入非結核性胸膜炎組（共29例）;使用ELISPOT試劑盒對胸腔積液進行T-SPOT.TB分析、日立HITACHI7600-110型全自動生化分析儀對胸腔積液進行ADA活性檢測、PCR反應檢測胸腔積液TBDNA水平。結果：T-SPOT.TB敏感度為80.0%（24/30），特異度為75.9%（22/29），結核性胸膜炎組抗原A孔平均計數(shù)（41.54±13.52）個，高于非結核性胸膜炎A孔平均計數(shù)（9.21±3.79）個，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。ADA敏感度為86.7%（26/30），特異度為79.3%（23/29），ADA均值（54.05±23.04）U/L，高于非結核性胸膜炎均值（13.55±7.66）U/L，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。TBDNA陽性比例33.3%（10/30）明顯高于非結核性胸膜炎陽性比例10.3%（3/29）（P<0.05），TBDNA診斷的敏感度為33.3%（10/30），特異度為86.7%（26/29）。外周血T-SPOT.TB敏感度、胸腔積液ADA敏感度均高于TBDNA（80.0%、86.7% vs 33.3%）（P<0.05），T-SPOT.TB敏感度與ADA敏感相近（80.8% vs 86.7%）（P>0.05）。TBDNA特異度均高于T-SPOT.TB特異度、ADA特異度（89.7% vs 75.9%、79.3%）（P<0.05）;T-SPOT.TB特異度、ADA特異度相近（75.9% vs 79.3%）（P>0.05）。當T-SPOT.TB、ADA、TBDNA3項檢測均為陽性，相比于T-SPOT.TB和ADA、T-SPOT.TB和TBDNA、ADA和TBDNA2項檢測為陽性，其特異度最高（96.6% vs 89.7%、93.1%、93.1%），但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。當T-SPOT.TB、ADA、TBDNA3項檢測中任意一項為陽性，相比于T-SPOT.TB和ADA、T-SPOT.TB和TBDNA、ADA和TBDNA2項檢測任意一項為陽性，其敏感度最高（96.7% vs 93.3%、76.7%、80.0%），但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論：T-SPOT.TB、ADA與TBDNA聯(lián)合檢測是敏感度、特異度較高的結核性胸膜炎的診斷方法，其串聯(lián)使用時，特異度最高，其并聯(lián)使用時，敏感度度最高。

【關鍵詞】 T細胞斑點試驗 腺苷脫氨酶 TBDNA 結核性胸膜炎 診斷價值

The Value of T-SPOT.TB， ADA and TBDNA in the Diagnosis of Tuberculous Pleurisy/CHEN Yancheng， HE Dan， ZENG Yunquan. //Medical Innovation of China， 2020， 17（13）： 0-036

[Abstract] Objective： To investigate the value of T-SPOT.TB， ADA and TBDNA in the diagnosis of tuberculous pleurisy. Method： From August 2016 to March 2019， 30 patients with tuberculous pleurisy were selected as tuberculous pleurisy group， 25 patients with Cancerous Pleural effusion， 2 patients with pneumonia pleural effusion and 2 patients with leakage fluid were selected as non tuberculous pleurisy group with a total of

29 cases. T-SPOT.TB analysis was performed for pleural effusion with ELISPOT kit， ADA activity test was performed for pleural effusion with Hitachi Hitachi 7600-110 automatic biochemical analyzer， and the level of TBDNA in pleural effusion was detected by PCR. Result： The sensitivity of T-SPOT.TB was 80.0% （24/30）， and the specificity was 75.9% （22/29）. The average number of a-hole in tuberculous pleurisy group was （41.54±13.52）， which was higher than that in non tuberculous pleurisy group （9.21±3.79）， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The sensitivity of ADA was 86.7% （26/30）， the specificity was 79.3% （23/29）， and the mean value of ADA was （54.05±23.04） U/L， which was higher than that of non tuberculous pleurisy （13.55±7.66） U/L，

and the difference was statistically significant （P<0.05）. The positive rate of TBDNA was 33.3% （10/30）， which was significantly higher than that of non tuberculous pleurisy 10.3% （3/29） （P<0.05）. The sensitivity and specificity of TBDNA diagnosis were 33.3% （10/30） and 86.7% （26/49）. The sensitivity of T-SPOT.TB in peripheral blood and ADA in pleural effusion were higher than that of TBDNA （80.0%， 86.7% vs 33.3%） （P<0.05）. The sensitivity of T-SPOT.TB was similar to that of ADA （80.8% vs 86.7%） ， and the difference was not statistically significant （P>0.05）. The specificity of TBDNA were higher than those of T-SPOT.TB and ADA （89.7% vs 75.9%， 79.3%）， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The specificity T-SPOT.TB and ADA were similar （75.9% vs 79.3%）， and the differences were not statistically significant （P>0.05）. When T-SPOT.TB， ADA and TBDNA were all positive， compared with T-SPOT.TB and ADA， T-SPOT.TB and TBDNA， ADA and TBDNA， the specificity was the highest （96.6% vs 89.7%， 93.1%， 93.1%）， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. When one of T-SPOT.TB， ADA and TBDNA was positive， compared with T-SPOT.TB and ADA， T-SPOT.TB and TBDNA， ADA and TBDNA， the sensitivity was the highest （96.7% vs 93.3%， 76.7%， 80.0%）， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion： The combination of T-SPOT.TB， ADA and TBDNA is the diagnostic methods of tuberculous pleurisy with high sensitivity and specificity. When they are used in series， the specificity is the highest. When they are used in parallel， the sensitivity is the highest.

[Key words] T cell spot test Adenosine deaminase TBDNA Tuberculous pleurisy Diagnostic value

First-authors address： Meizhou Peoples Hospital， Meizhou 514000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.13.008

結核性胸膜炎是一種由結核分枝桿菌引起的呼吸系統(tǒng)疾病，以發(fā)熱、胸痛和咳嗽為主要臨床表現(xiàn)[1-2]。結核性胸膜炎的診斷仍然受到檢測方法和技術的限制。胸片和超聲技術在結核性胸膜炎診斷中的應用由于特異性差而受到限制，這反過來增加了對該病的診斷和治療難度。結核性胸膜炎的明確診斷取決于胸膜積液或胸膜組織中結核分枝桿菌的分離，但分枝桿菌培養(yǎng)很費時，需要數(shù)周才能獲得結果[3]。此外，即使采用先進的培養(yǎng)技術，積液的診斷率仍可達到63%。盡管也可以通過胸膜組織學方法進行診斷，但對于老年人，潛在合并癥和高危人群，其可能不耐受。細胞免疫功能在免疫疾病的發(fā)展中起重要作用。相關研究表明，結核分枝桿菌的控制與巨噬細胞密切相關[4]。據(jù)報道，T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）在檢測肺外結核方面具有較高的敏感性[5-6]，多種胸膜生物標志物已用于輔助結核性胸膜炎的診斷，這些包括腺苷脫氨酶（ADA），干擾素-γ（IFN-γ）和胸腔積液TB-DNA的測定。ADA可以參與多種炎癥反應，可以誘導組織損傷和炎癥反應[7]。薈萃分析顯示，ADA和TB-DNA對于結核性胸膜炎似乎相對準確盡管薈萃分析顯示，TB-DNA雖然是結核分枝桿菌感染的有力指標，但在胸腔積液中TB-DNA并不優(yōu)于ADA和IFN-γ水平[8]。本研究擬探討T-SPOT.TB、ADA、TBDNA對結核性胸膜炎的診斷價值，為結核性胸膜炎的早期診斷及治療提高理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本院2016年8月-2019年3月收治的結核性胸膜炎患者30例以及非結核性胸膜炎29例（25例癌性胸腔積液、2例肺炎性胸腔積液、2例膿胸）為研究對象。（1）納入標準：①結核性胸膜炎患者經臨床癥狀、胸膜活檢、X線檢查確診;②涂片或培養(yǎng)有結核分枝桿菌;③組織或胸膜活檢病理為結核病變;④經抗結核治療胸腔積液明顯吸收。（2）排除標準：①妊娠期孕婦;②嚴重呼吸道疾病者;③近3個月有手術、創(chuàng)傷史。收集兩組患者臨床特征和實驗室檢查結果（胸膜液中的蛋白質和乳酸脫氫酶、痰和胸膜液的耐酸涂片和分枝桿菌培養(yǎng)）。所有患者接受了胸腔穿刺術，并收集50 mL胸膜液。常規(guī)診斷測試包括細胞計數(shù)，耐酸涂片以及細菌，真菌和分枝桿菌的培養(yǎng)。胸部影像學包括放射線照片和計算機斷層掃描（CT）掃描。記錄胸腔積液的位置和數(shù)量（如果胸腔不透性小于胸部X線檢查的一半胸腔積液，則胸腔積液的數(shù)量為小;反之為大）。該研究經本院醫(yī)學倫理協(xié)會批準，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法 （1）T-SPOT.TB的檢測：使用ELISPOT試劑盒（T-SPOT-TB;Oxford Immunotec Ltd，英國牛津）進行T-SPOT.TB分析。簡而言之，使用Ficolle Hypaque分離胸腔積液單核細胞（PEMC），然后洗滌，重新懸浮并計數(shù)。將PEMC添加到用小鼠包被的孔中（每孔250 000個PEMC）。單克隆抗IFN-γ抗體包含6-kDa早期分泌的抗原靶標（ESAT-6）或培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP10）和促分裂原（植物血凝素）（陽性對照），進行板的培養(yǎng)，洗滌，復染和可視化。

（2）ADA的檢測：ADA檢測采用速率法，儀器采用日立HITACHI7600-110型全自動生化分析儀。ADA活性使用市售試劑盒（腺苷脫氨酶測定試劑盒，Diazyme Laboratories，Poway，CA，美國）在37 ℃下進行比色測定的。抽取胸腔積液3 mL，離心取上清液，通過添加ADA特異性抑制劑來確定ADA同工酶的活性。ADA的單位定義為在37 ℃下每分鐘從腺苷產生1 μmol肌苷的酶量，結果以每升胸膜液國際單位（IU/L）表示。（3）TBDNA的測定：患者胸腔積液10 mL加入180 mL消化液（通過將10 mL Tween 20加到2 mL TE Buffer，pH 8.0中制備）并渦旋混合。以10 000 rpm離心1 min后，將20 mL蛋白酶K（20 mg/mL）添加至下部澄清相中并輕輕混合。將樣品在56℃孵育1 h，然后在90 ℃孵育 以滅活蛋白酶K。短暫離心后，將較低的澄清相轉移到easyMAG容器中。使用Generic 2.0.1程序提取DNA。使用TBDNA引物和TaqMan探針。每個

30 mL反應液均包含15 μL Quantitech PCR Mastermix（QIAGEN），每種引物0.3 μM，0.2 μM FAM（熒光素）標記的MTBC探針，0.05 μM Cy5標記的PhHV探針和10 μL DNA。使用ABI Prism 7500序列檢測系統(tǒng)（Applied Biosystems，Warrington，UK）使用擴增曲線進行PCR擴增：在50 ℃進行2 min的循環(huán)，在95 ℃進行10 min的循環(huán)，然后進行15次的50個循環(huán)在90 ℃的溫度下進行1 s，在60 ℃的溫度下進行1 min，6CT截止值。當CT值為40表示實時PCR陽性結果。

1.3 診斷標準 （1）T-SPOT.TB的診斷標準：對斑點進行計數(shù)，如果測試孔中的斑點數(shù)減去對照孔中的斑點數(shù)≥6，或兩個測試孔中的斑點計數(shù)至少是陰性對照孔的兩倍，為陽性，反之則為陰性;

（2）ADA的診斷標準：根據(jù)試劑盒設定的指標臨界值，ADA<24 U/L為陰性，反之則為陰性;（3）TBDNA的診斷標準：當TBDNAC的T值≥40表示實時PCR陽性結果，反之則為陰性。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟禁進行分析，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 T-SPOT.TB、ADA、TBDNA的單項診斷價

值 T-SPOT.TB敏感度為80.0%（24/30），特異度為75.9%（22/29），結核性胸膜炎組抗原A孔平均計數(shù)（41.54±13.52）個，高于非結核性胸膜炎A孔平均計數(shù)（9.21±3.79）個，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。ADA敏感度為86.7%（26/30），特異度為79.3%（23/29），ADA均值（54.05±23.04）U/L，

高于非結核性胸膜炎均值（13.55±7.66）U/L，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。TBDNA陽性比例33.3%（10/30）明顯高于非結核性胸膜炎陽性比例10.3%（3/29）（P<0.05），TBDNA診斷的敏感度為33.3%（10/30），特異度為86.7%（26/29）。外周血T-SPOT.TB敏感度、胸腔積液ADA敏感度均高于TBDNA（80.0%、86.7% vs 33.3%）（P<0.05），T-SPOT.TB敏感度與ADA敏感相近（80.8% vs 86.7%）（P>0.05）。TBDNA特異度均高于T-SPOT.TB特異度、ADA特異度（89.7% vs 75.9%、79.3%）（P<0.05）;T-SPOT.TB特異度、ADA特異度相近（75.9% vs 79.3%）（P>0.05）。見表1。

2.2 T-SPOT.TB、ADA、TBDNA的串聯(lián)試驗的診斷價值分析 當T-SPOT.TB、ADA、TBDNA3項檢測均為陽性，相比于T-SPOT.TB和ADA、T-SPOT.TB和TBDNA、ADA和TBDNA2項檢測為陽性，其特異度最高（96.6% vs 89.7%、93.1%、93.1%），但差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 T-SPOT.TB、ADA、TBDNA的并聯(lián)試驗的診斷價值分析 當T-SPOT.TB、ADA、TBDNA3項檢測中任意一項為陽性，相比于T-SPOT.TB和ADA、T-SPOT.TB和TBDNA、ADA和TBDNA2項檢測任意一項為陽性，其敏感度最高（96.7% vs 93.3%、76.7%、80.0%），但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

結核性胸膜炎是繼淋巴結結核之后活動性結核桿菌感染的第二常見的肺外表現(xiàn)，占結核病例的23%，在西歐占胸腔積液的30%。從疾病發(fā)作開始，可能在7～30 d產生胸腔積液。作為一種常見的單側胸腔積液疾病，結核性胸膜炎可影響任何年齡的患者。胸腔積液的形成是結核性胸膜炎的主要特征。研究表明，世界范圍內結核性胸膜炎的發(fā)病率相對較高，主要類型是結核性胸膜炎。臨床癥狀的觀察和生化檢查對胸腔積液的檢測對于結核性胸膜炎的診斷都是重要的。值得注意的是，缺乏典型的表現(xiàn)以及生化指標和常規(guī)檢查的低特異性增加了診斷的難度。因此，需要開發(fā)可靠的結核性胸膜炎診斷方法。

作為結核病診斷的主要方法，T-SPOT.TB可用于準確確定可分泌抗體和細胞因子的細胞數(shù)量，因此T-SPOT.TB的結果可反映體內的細胞因子水平[9-10]。研究表明，使用T-SPOT.TB技術可以提高結核性胸膜炎診斷的陽性率，但是有誤診的報道。因此，需要聯(lián)合診斷以提高結核性胸膜炎的陽性診斷率[11]。T-SPOT.TB對結核性胸膜炎的診斷性能已在各種環(huán)境下進行了檢查，大多數(shù)研究從敏感性和特異性分析中排除了中間結果。 盡管研究之間存在異質性，但有兩個重要發(fā)現(xiàn)。 首先，在低負荷情況下，具有高度免疫能力的患者組的研究顯示，由于強烈的胸膜T細胞反應，假陰性結果較少。其次，胸膜液T-SPOT.TB檢測靈敏度更高，不確定的結果較少，比QuantiFERON-TB金管內（QFT-GIT）分析法要高，這反映了T-SPOT.TB分析法對單核細胞數(shù)量的強制性要求[12-13]。ADA是T輔助淋巴細胞亞群的特征性細胞因子。結核分枝桿菌感染后，病變部位的巨噬細胞將被激活，胸腔積液和血液中的ADA含量將逐漸增加。研究表明，ADA對結核病中Th1型免疫反應具有雙重調節(jié)作用。一方面，ADA可以誘導CD4+向Th1分化。另一方面，ADA可以抑制Th1細胞增殖，從而抑制由Th1型免疫反應引起的對身體的損害[14-15]。TBDNA編碼的TBDNA蛋白具有228個氨基酸，相對分子質量約為24 000，是一種僅由MTB復合體（包括MTB，牛分枝桿菌和非洲分枝桿菌）分泌的特定蛋白。蛋白在復制的早期由結合桿菌復合物分泌。TBDNA約占上清液培養(yǎng)濾液中總蛋白的8%。作為候選診斷標志物，TBDNA一個突出優(yōu)點是它僅在極少數(shù)結核菌株中表達（例如東京，莫勞和俄羅斯等），而在絕大多數(shù)結核菌株中卻不表達[16]。在活動性結核病檢測中，用作皮膚測試抗原的TBDNA的敏感性和特異性分別高達98.1和100%。使用生物信息學，發(fā)現(xiàn)沒有表位與TBDNA蛋白相似，這表明TBDNA是獨特的[17-18]。

本次研究結果顯示，T-SPOT.TB敏感度、ADA敏感度均高于TBDNA（80.0%、86.7% vs33.3%），T-SPOT.TB敏感度與ADA敏感相近（80.0% vs 86.7%）。TBDNA特異度均高于外周血T-SPOT.TB特異度、胸腔積液ADA特異度（89.7% vs 75.9%、79.3%）;T-SPOT.TB特異度、ADA特異度（75.9% vs 79.3%）相近。當T-SPOT.TB、ADA、TBDNA3項檢測均為陽性，相比于T-SPOT.TB和ADA、T-SPOT.TB和TBDNA、ADA和TBDNA2項檢測為陽性，其特異度最高（96.6% vs 89.7%、93.1%、93.1%），但差異無統(tǒng)計學意義。說明T-SPOT.TB、ADA、TBDNA3串聯(lián)診斷能夠更好地降低誤診率。當T-SPOT.TB、ADA、TBDNA3項檢測中任意一項為陽性，相比于T-SPOT.TB和ADA、T-SPOT.TB和TBDNA、ADA和TBDNA2項檢測任意一項為陽性，其敏感度最高（96.7% vs 93.3%、76.7%、80.0%），但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。說明T-SPOT.TB、ADA、TBDNA并聯(lián)診斷能夠更好地降低漏診率。

綜上所述，T-SPOT.TB、ADA、TBDNA是敏感度、特異度較高的結核性胸膜炎的診斷方法，其串聯(lián)使用時，特異度最高，其并聯(lián)使用時，敏感度度最高。

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（收稿日期：2020-03-20） （本文編輯：周亞杰）