徐志平 卞龍艷 聞純

江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)教研室，江蘇 鹽城 224005

骨質(zhì)疏松是一種常見的骨骼疾病，影響全球20多億人[1]。骨質(zhì)疏松的特征是骨密度降低，骨強(qiáng)度降低，骨組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[2]。女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松導(dǎo)致骨折風(fēng)險增加。在中國，40.1%的50歲以上女性患有骨質(zhì)疏松。骨重建隨著成骨細(xì)胞骨形成減少和破骨細(xì)胞骨吸收增加而改變[3]。骨密度(bone mineral density, BMD)在骨質(zhì)疏松篩查中用于評估和診斷[4]。骨微觀結(jié)構(gòu)的改變和骨密度的降低導(dǎo)致機(jī)械強(qiáng)度降低，微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(Micro-CT)也被用來診斷骨質(zhì)疏松[5]。目前已建立了幾種骨質(zhì)疏松動物模型，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松是最常見的骨質(zhì)疏松模型之一[6]。文獻(xiàn)[7]表明，糖皮質(zhì)激素治療使骨基質(zhì)形成減少，骨吸收增加，從而減少了骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的產(chǎn)生。此外，糖皮質(zhì)激素可減少成骨細(xì)胞的自噬并誘導(dǎo)其凋亡[8]。糖皮質(zhì)激素通過促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)和下調(diào)Bcl-xl的表達(dá)而引起細(xì)胞凋亡[9]。在過去的幾十年中，替代醫(yī)學(xué)在治療包括神經(jīng)性疾病在內(nèi)的幾種疾病方面顯示出了潛力。防己諾林堿是一種生物堿，據(jù)報道[10]具有抗炎活性。防己諾林堿還具有很強(qiáng)的自由基清除、降壓、抗癌、抗氧化、抗血栓等作用[11]。因此，本研究將探討防己諾林堿對骨質(zhì)疏松和骨丟失的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

12周齡雄性Wistar大鼠，體重240～280 g，購自上海動物史萊克公司。將動物飼養(yǎng)在濕度(60±5)%和溫度(26±2)℃的環(huán)境中，具有12 h夜間/白天循環(huán)?；瘜W(xué)品防己諾林堿購自Sigma Aldrich(CA，USA);TRIzol試劑和cDNA合成試劑盒購自Thermo Fisher Scientific(MA，USA);Lowry蛋白質(zhì)測定試劑盒購自Bio-Rad Laboratories(CA，USA);抗Bcl-2抗體(1∶400)、抗caspase-3(1∶500)、抗BMP2(1∶800)、抗Beclin-1(1∶600)和抗RANKL(1∶1 000)從Santa Cruz Biotechnology(TX，USA)獲得;抗LC3(1∶1 000)和抗GAPDH(1∶1 500)來自Cell Signaling Technology(MA，USA)。

1.2 方法

1.2.1研究方案：將所有動物分成5個獨(dú)立研究的組：未治療的對照組(A組);潑尼松龍治療組(B組)皮下注射潑尼松龍(2.5 mg/kg);防己諾林堿低劑量組(C組)給予腹腔注射防己諾林堿(1 mg/kg)聯(lián)合皮下注射潑尼松龍(2.5 mg/kg);防己諾林堿中劑量組(D組)給予腹腔注射防己諾林堿(3 mg/kg)聯(lián)合皮下注射潑尼松龍(2.5 mg/kg);防己諾林堿高劑量組(E組)給予防己諾林堿(10 mg/kg)聯(lián)合皮下注射潑尼松龍(2.5 mg/kg)。治療1個月后評估防己諾林堿對骨質(zhì)疏松癥的影響。

1.2.2檢測指標(biāo)評估：在治療方案結(jié)束時，分離大鼠雙側(cè)股骨并在室溫下用1%甲醛固定過夜，然后在室溫下浸入70%乙醇中2 h。使用微型CT儀器SCANCO圖像處理語言軟件。使用雙能X線DCS-600 Aloka骨密度儀測量分離骨樣品的BMD。將動物麻醉后收集血液進(jìn)行生化參數(shù)的評估，2 000 r/min, 離心10 min分離血清。根據(jù)制造商的說明，使用自動分析儀在血清中測定堿性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性以及磷和鈣的濃度。ELISA試劑盒用于測定I型片段膠原(CTX)和骨鈣蛋白(OC)蛋白的血清濃度。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：在治療方案結(jié)束時，從所有動物中分離脛骨組織，并按照制造商給出的說明使用TRIzol試劑提取總RNA。根據(jù)cDNA合成試劑盒制造商的說明，從RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA。使用StepOne實(shí)時PCR系統(tǒng)進(jìn)行定量PCR，并將GAPDH用作內(nèi)部對照。通過在95 ℃熱循環(huán)10 min進(jìn)行PCR，然后在95 ℃、45 ℃、60 ℃下進(jìn)行40個循環(huán)15 s，最后延伸步驟95 ℃15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s。使用的引物是核因子-κB配體(RANKL)、自噬蛋白(ATG)5、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(RUNX)2、Beclin-1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)和GAPDH的受體激活劑。比較Cq方法用于測定相對基因表達(dá)，GAPDH用作內(nèi)部對照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。使用單向ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 通過Dunnett的事后檢驗(yàn)(GraphPad Prism 6.1，CA，USA)進(jìn)行多重比較。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 防己諾林堿對微結(jié)構(gòu)參數(shù)和BMD的影響

顯微CT分析顯示出防己諾林堿對潑尼松龍誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠股骨干骺端的骨損失影響(圖1、表1)。與對照組相比，在潑尼松龍組中發(fā)現(xiàn)的微結(jié)構(gòu)參數(shù)如骨表面密度、小梁骨組織體積密度、小梁數(shù)和小梁數(shù)厚度顯著降低(P<0.05，P<0.01)。然而，用防己諾林堿治療顯著減弱了潑尼松龍誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨干骺端微結(jié)構(gòu)參數(shù)的改變。潑尼松龍組的骨密度[(0.128±0.007) g/cm3]顯著低于對照組[(0.297±0.013)g/cm3)]。與潑尼松龍組相比，防己諾林堿治療組的BMD顯著增加至(0.273±0.017) g/cm3。

2.2 防己諾林堿對大鼠血清生化參數(shù)的影響

本研究進(jìn)一步評估了防己諾林堿對潑尼松龍誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥大鼠血清生化指標(biāo)的影響，如圖2所示。與對照組相比，潑尼松龍組大鼠血清中

圖1 防己諾林堿對潑尼松龍所致骨質(zhì)疏松大鼠股骨三維重建顯微CT圖像的影響 A：對照組;B：潑尼松龍治療組;C：防己諾林堿低劑量組;D：防己諾林堿中劑量組;E：防己諾林堿高劑量組。Fig.1 Assessment of the effect of fangchinoline on 3D-reconstructed micro-CT images of the femur of the prednisolone-induced osteoporosis rats

組別骨表面小梁密度/mm-1骨小梁體積骨密度/%小梁數(shù)目/mm-1小梁厚度/mm骨密度/(g/cm3)A組3.92±0.4237.21±2.971.42±0.0360.279±0.0410.297±0.013B組2.36±0.28##22.49±1.42##0.83±0.028##0.246±0.017#0.128±0.007##C組2.61±0.3326.33±1.690.94±0.0190.258±0.0230.163±0.004*D組3.17±0.29**32.84±2.16**1.27±0.023**0.264±0.014*0.236±0.011**E組3.72±0.32**36.42±2.46**1.58±0.031**0.283±0.031*0.273±0.017**

注：與對照組相比，#P<0.01; 與潑尼松龍組相比，*P<0.05，*P<0.01。

圖2 防己諾林堿對潑尼松龍所致骨質(zhì)疏松大鼠血清生化指標(biāo)的影響 A：對照組;B：潑尼松龍治療組;C：防己諾林堿低劑量組;D：防己諾林堿中劑量組;E：防己諾林堿高劑量組。注：與對照組相比，#P<0.01; 與潑尼松龍組相比，*P<0.05，*P<0.01。Fig.2 Assessment of the effect of fangchinoline on biochemical parameters in the serum of prednisolone-induced osteoporosis rat model

ALP和TRAP活性以及Ca、P和CTX水平顯著增加(P<0.01)。此外，與對照組相比，潑尼松龍組大鼠血清中OC水平顯著降低(P<0.01)。用防己諾林堿治療改變了潑尼松龍誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥大鼠血清中的生化參數(shù)，例如ALP和TRAP的活性以及Ca、P、OC和CTX的水平。

2.3 防己諾林堿對RANKL、ATG-5、RUNX-2、Beclin-1基因表達(dá)的影響

防己諾林堿對RANKL、ATG-5、RUNX-2、Beclin-1基因表達(dá)的影響如圖3所示。潑尼松龍誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨組織中BMP2的水平較對照組顯著降低(P<0.01)。與對照組相比，潑尼松龍組股骨組織中ATG-5、RUNX-2和Beclin-1的基因表達(dá)顯著降低并且RANKL的表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)。然而，與潑尼松龍組相比，用防己諾林堿治療的C、D和E組顯著增強(qiáng)了ATG-5、RUNX-2、Beclin-1和BMP2的基因表達(dá)，并且股骨組織中RANKL的表達(dá)顯著降低(P<0.01)；且上述療效以劑量依賴的方式出現(xiàn)。

圖3 防己諾林堿對潑尼松龍所致骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織RANKL、ATG-5、RUNX-2、Beclin-1、BMP2基因表達(dá)的影響 A：對照組;B：潑尼松龍治療組;C：防己諾林堿低劑量組;D：防己諾林堿中劑量組;E：防己諾林堿高劑量組。注：與對照組相比，#P<0.01; 與潑尼松龍組相比，*P<0.05，*P<0.01。Fig.3 Assessment of the effect of fangchinoline on gene expression of RANKL, ATG-5, RUNX-2, Beclin-1 and BMP2 in the femur tissues of prednisolone-induced osteoporosis rat model

3 討論

之前的一項(xiàng)研究[12]表明，潑尼松龍誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥是一種成熟的骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，因?yàn)檠逯械纳瘏?shù)水平發(fā)生了改變，BMD降低。本次研究結(jié)果表明防己諾林堿治療顯著減弱了血清中生化參數(shù)的改變水平，并且還改善了潑尼松龍誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨BMD。據(jù)報道[13]，潑尼松龍誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥大鼠中，骨的微結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變，從而降低了骨強(qiáng)度。使用防己諾林堿治療會影響潑尼松龍誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨干骺端中微觀結(jié)構(gòu)的改變。

文獻(xiàn)[14]顯示，成骨細(xì)胞分泌BMP2，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的礦化和增殖。 此外據(jù)報道[15]，通過RANK的表達(dá)和RUNX-2的表達(dá)激活破骨細(xì)胞，與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)。本次研究表明，使用防己諾林堿治療可以劑量依賴性地減弱潑尼松龍誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨干骺端骨組織中BMP-2、RANKL和RUNX-2蛋白的表達(dá)。自噬也是骨質(zhì)疏松癥發(fā)展的機(jī)制之一，據(jù)報道[16]，一些蛋白質(zhì)如ATG-5和Beclin-1是自噬體的調(diào)節(jié)蛋白，并且使用防己諾林堿治療改變了這幾種蛋白質(zhì)的水平，如ATG-5和Beclin-1，以劑量依賴的方式在潑尼松龍誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨組織中表達(dá)。

綜上，防己諾林堿可通過誘導(dǎo)自噬來抑制成骨細(xì)胞的凋亡并防止?jié)娔崴升堈T導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥大鼠骨質(zhì)流失，其對骨質(zhì)疏松癥具有很強(qiáng)的活性，可能是一種很有意義的臨床研究分子。