歐陽(yáng)利云 唐穎 上官文峰

河南科技大學(xué)第三附屬醫(yī)院脊柱外科，河南 洛陽(yáng) 471003

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)的主要特征為全身骨量的逐漸減少，骨組織結(jié)構(gòu)紊亂,骨強(qiáng)度減低，骨的脆性增加，極易發(fā)生骨折。其病理機(jī)制為骨吸收代謝后，未分化的干細(xì)胞不能及時(shí)的分化為成骨細(xì)胞，導(dǎo)致了骨形成不足[1-3]。近年來(lái)對(duì)于OP治療方法有眾多的研究，如藥物治療、中醫(yī)針灸、中藥治療等，但臨床治療效果仍有待進(jìn)一步提高。干細(xì)胞移植治療為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[4-5]，即通過(guò)干細(xì)胞移植發(fā)揮對(duì)骨質(zhì)疏松的治療作用。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一類能夠循環(huán)、增殖并有著在特定情況下分化為各種細(xì)胞的功能[6-7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)切除雌性大鼠卵巢，降低大鼠雌激素分泌，從而構(gòu)建絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，進(jìn)而通過(guò)尾靜脈移植同源異體的EPCs，評(píng)估該治療對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠TGF-β/Smads通路的影響及治療效果。

1 材料和方法

1.1 材料及來(lái)源

骨密度測(cè)定儀器(CHAILENGE雙能X線， 法國(guó) GK 公司);胎牛血清(貨號(hào)16000-044);DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)11965-092,美國(guó)Gibco BRL公司);胰蛋白酶(Amreseo公司);Trizol試劑盒(上海華舜公司);體重計(jì)(美國(guó)GE公司); BAP酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒、 CTX-I檢測(cè)試劑盒、 TRAP5b檢測(cè)試劑盒(寶生物工程有限公司，大連);TGF-β1、Smad2、Smad3、GAPDH兔抗大鼠多克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(英國(guó)Abcam公司)；胰蛋白酶、RT-PCR試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);引物(上海生工);大鼠EPCs(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：60只Wistar大鼠，均為雌性、未孕，體重220～260 g，由河南科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(豫)2014-0010，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(豫) 2014-0014。所有大鼠均在相同條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。隨機(jī)均分為假手術(shù)組、模型組及EPCs組，每組20只。

1.2.2EPCs的復(fù)蘇及培養(yǎng)：將EPCs恒溫水浴箱快速?gòu)?fù)蘇，待細(xì)胞完全融化后，離心棄上清，PBS洗滌細(xì)胞，以DMEM完全培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞重懸，調(diào)整EPCs濃度至2×l08/L，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔2 d換液1次，定期換液及傳代，培養(yǎng)1～14 d，觀察到細(xì)胞的增殖良好。

1.2.3模型的建立：吸入乙醚麻醉后固定大鼠，消毒皮膚后，以腰椎后正中位行皮膚切開(kāi)，分離腰椎兩側(cè)肌肉，暴露并打開(kāi)腹膜，顯露出雙側(cè)卵巢。模型組及EPCs組將雙側(cè)卵巢完全切除，假手術(shù)組同部位、同法切皮，僅切除卵巢周邊少許組織，但不行卵巢切除，手術(shù)完成后腹腔撒入青霉素粉末，依次逐層縫合組織和皮膚。 1周時(shí)進(jìn)行尾靜脈注射治療，假手術(shù)組注射L-DMEM培養(yǎng)液0.5 mL、模型組注射L-DMEM培養(yǎng)液0.5 mL、EPCs組注射EPCs懸液0.5 mL，2×l08個(gè)/L，連續(xù)注射7 d。

1.2.4測(cè)定各組大鼠的體質(zhì)量：造模后1、4、8、11、13周測(cè)定并記錄每組大鼠的體質(zhì)量。過(guò)程如下，將體重計(jì)置于水平桌面，置“0”后體重計(jì)上測(cè)定小桶質(zhì)量并記錄，后將各組每只大鼠分別置于小桶中測(cè)量并記錄，此讀數(shù)減去小桶質(zhì)量讀數(shù)為大鼠體質(zhì)量，重復(fù)3次測(cè)定，取均值。

1.2.5ELISA法檢測(cè)血清 25(OH)D、CTX-I、BAP、TRAP5b的表達(dá)變化：13周時(shí)，隨機(jī)取每組各5只大鼠，仰臥位固定后，經(jīng)大鼠尾靜脈通過(guò)注射器采血，將血液注入離心管后，離心半徑140 mm，離心3 000 r/min，離心15 min。吸取上清液，通過(guò)ELISA法行血清25(OH)D、BAP、CTX-I、TRAP5b含量測(cè)定，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，記錄檢測(cè)結(jié)果。

1.2.6骨密度及骨鈣含量測(cè)定:于造模后第13周，從每組大鼠中隨機(jī)選5只，通過(guò)頸部脫臼法處死。固定后，于無(wú)菌條件下取出大鼠的右側(cè)股骨，對(duì)大鼠股骨中點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，分別行大鼠右側(cè)股骨中點(diǎn)、遠(yuǎn)端及近端骨密度檢測(cè)。經(jīng)骨密度儀測(cè)定并記錄結(jié)果。取左側(cè)股骨在支架上固定，用手術(shù)刀剔除股骨上附著的組織，剔除干凈后，用原子吸收法對(duì)股骨鈣含量進(jìn)行測(cè)定并記錄。

1.2.7股骨生物力學(xué)檢測(cè)及HE染色：于造模后第13周，從每組大鼠中隨機(jī)選5只，通過(guò)頸部脫臼法處死。將大鼠在支架上固定，通過(guò)手術(shù)刀取出大鼠的股骨，用手術(shù)刀剔除股骨上附著的組織，然后對(duì)股骨的生物力學(xué)進(jìn)行測(cè)試，通過(guò)三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，將每組大鼠處理后的股骨放在試驗(yàn)機(jī)上測(cè)試，加載速度為2.0 mm/min，跨距設(shè)置為17 mm，根據(jù)結(jié)果描繪應(yīng)力-應(yīng)變曲線。然后用10%的甲醛行股骨固定，制作股骨組織切片；通過(guò)梯度乙醇脫水后，經(jīng)過(guò)石蠟包埋，制作4～ 5 μm厚的連續(xù)切片，脫蠟，行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.8TGF-β1、Smad2、Smad3基因表達(dá)檢測(cè)：將各組剩余大鼠以頸部脫臼法處死，取大鼠椎體組織90 mg，液氮至凍后研磨，按照Trizol 試劑說(shuō)明書步驟提取椎體組織總RNA，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的總含量，通過(guò)RT-PCR兩步法試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。TGF-β1上游引物：5′-GTCAGACATTCGGGAGCAG-3′，下游引物：5′-AGACAGAAGTTGGCATGGTAGC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為558 bp；Smad2上游引物：5′-GACTATACCCTCAATACCAT-3′，下游引物：5′-CGAAAGCCGTACTCCATTCCAG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為610 bp; Smad3上游引物：5′-ACAATAACTTGGACCTACAGCC-3′，下游引物：5′-GTCAACTGGTAGACAGCCTCA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為454 bp;內(nèi)參GAPDH上游引物：5′- GAGGACCAGGTTGTCTCC TG-3′，下游引物：5′- GGATGGAATTGTGAGGGAGA -3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為300 bp。PCR反應(yīng)條件如下:于94 ℃條件下變性，1 min, 55 ℃溫度下退火，退火時(shí)長(zhǎng)為30 s，于72 ℃延伸，延伸1 min，共45個(gè)循環(huán)。

1.2.9TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)檢測(cè)：將RT-PCR提取后的剩余物以1 500 r/min 離心30 min，取上清為粗體蛋白，通過(guò)BCA試劑盒行蛋白濃度測(cè)定。每組取蛋白40 μg，行10% SDS-PAGE凝膠電泳(條件為65 V，30 min；95 V，90 min)，蛋白電泳分離后通過(guò)半干法將蛋白電轉(zhuǎn)于硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h (或4 ℃過(guò)夜)；然后加入相應(yīng)一抗TGF-β1、Smad2、Smad3鼠單抗(1∶100)、GAPDH鼠單抗(1∶800)4 ℃孵育過(guò)夜。PBS將未結(jié)合的抗體洗去，加入二抗羊抗兔IgG(1∶1 000)孵育1 h，將未結(jié)合蛋白洗去，經(jīng)ECL發(fā)光顯色后，X線照相后，通過(guò)Quantityone 軟件行灰度值統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 EPCs形態(tài)觀察

顯微鏡下觀察，培養(yǎng)1周內(nèi)可見(jiàn)貼壁的EPCs逐漸增多，且體積增大，細(xì)胞形態(tài)呈紡綞形、多邊形或類圓形，見(jiàn)圖1 A；繼續(xù)培養(yǎng)1 周可見(jiàn)貼壁細(xì)胞形態(tài)呈“鋪路石”樣的外觀，細(xì)胞數(shù)顯著增多，表明細(xì)胞增殖良好，見(jiàn)圖1B。

圖1 EPCs形態(tài)觀察 (×100) A:傳代1周內(nèi)的EPCs(×100);B:培養(yǎng)2 周時(shí)的EPCs(×100)。Fig.1 Morphological observation of EPCs A: EPCs within 1 week of passage (×100); B: EPCs at 2 weeks of culture (×100).

2.2 各組大鼠的體質(zhì)量

大鼠的體質(zhì)量測(cè)定結(jié)果表明三組大鼠的體重均逐漸增加，符合動(dòng)物生長(zhǎng)規(guī)律。于造模后8周起，模型組體質(zhì)量較假手術(shù)組升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠的體質(zhì)量比較Fig.2 Comparison of body mass in each group of rats

2.3 骨密度及骨鈣含量測(cè)定

在造模后第13周，模型組股骨骨密度及骨鈣含量較假手術(shù)組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EPCs組股骨骨密度和骨鈣含量較模型組顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表 1。表明EPCs移植治療能夠有效提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨密度和骨鈣含量，發(fā)揮治療作用。

2.4 各組大鼠25(OH)D、CTX-I、BAP、TRAP5b的表達(dá)變化

在造模后第13周，與假手術(shù)組比較，模型組血清25(OH)D、BAP水平降低，CTX-I、TRAP5b的水平升高(P<0.05)。與模型組比較，EPCs組血清25(OH)D、BAP水平升高，CTX-I、TRAP5b水平降低(P<0.05)。表明EPCs移植治療能夠有效地提高去卵巢OP大鼠血清25(OH)D、BAP水平、降低 CTX-I、TRAP5b水平，見(jiàn)表2。

表1 大鼠股骨BMD值和骨鈣含量測(cè)定Table 1 BMD and bone calcium content in rat femur

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表2 大鼠血清中25(OH)D、CTX-I、BAP、TRAP5b的表達(dá)Table 2 Expression of 25(OH)D, CTX-I, BAP and TRAP5b in rat serum

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

圖3 大鼠股骨組織病理學(xué)形態(tài)變化(×100)A：模型組;B：EPCs組;C：假手術(shù)組。Fig.3 Pathological changes in rat femoral tissue (×100) A：model group；B：EPCs group；C：sham operation group.

2.5 生物力學(xué)性能的變化

在造模后第13周，通過(guò)三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)生物力學(xué)性能，顯示模型組極限載荷、極限應(yīng)力和彈性模量明顯低于假手術(shù)組(P<0.05),EPCs組的極限載荷和彈性模量比模型組有顯著增高(P<0.05),見(jiàn)表3。

2.6 HE染色

圖3所示13周時(shí)，模型組骨小梁有斷裂，變稀疏，排列紊亂，間隙增大;EPCs組骨小梁窄較之減輕，部分骨小梁較粗，骨小梁排列較之規(guī)則、間隙增小于模型組;假手術(shù)組骨組織結(jié)構(gòu)完整，以上病理變化進(jìn)一步減輕。

表3 大鼠股骨生物力學(xué)檢測(cè)Table 3 Biomechanical testing of rat femur

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.7 TGF-β/Smad信號(hào)通路基因表達(dá)影響

圖4所示，TGF-β/Smads信號(hào)通路檢測(cè)顯示EPCs組TGF-β1及Smad2、Smad3基因表達(dá)上調(diào)，與模型組相比顯著升高，與假手術(shù)組相近(P<0.05)。表明EPCs移植可能通過(guò)調(diào)高TGF-β/Smads通路發(fā)揮作用。

圖4 各組椎體TGF-β/Smad基因表達(dá) A:TGF-β/Smad 基因表達(dá)條帶圖;B:TGF-β/Smad 基因表達(dá)水平。Fig.4 TGF-β/Smad gene expression in vertebral body of each group A: TGF-β/Smad gene expression band map; B: TGF-β/Smad gene expression.

2.8 TGF-β/Smad信號(hào)通路蛋白表達(dá)影響

圖5所示， TGF-β/Smads信號(hào)通路檢測(cè)顯示EPCs組TGF-β1及Smad2、Smad3信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，與模型組相比顯著升高，與假手術(shù)組相近(P<0.05)。表明EPCs移植可能通過(guò)調(diào)高TGF-β/Smads通路發(fā)揮作用。

圖5 各組椎體TGF-β/Smad蛋白表達(dá) A:TGF-β/Smad 蛋白表達(dá)條帶圖;B:TGF-β/Smad 蛋白表達(dá)水平。Fig.5 TGF-β/Smad protein expression in vertebral body of each group A: TGF-β/Smad protein expression band map; B: TGF-β/Smad Protein Expression.

3 討論

骨質(zhì)疏松為老年女性常見(jiàn)病之一，其根本原因?yàn)榕愿昶诤螅瑱C(jī)體雌激素水平逐漸降低[8]，骨吸收與骨形成的平衡受到影響，導(dǎo)致骨骼密度和骨鈣含量降低，最終骨強(qiáng)度變小，骨脆性增加，極易發(fā)生骨折[9]。大鼠卵巢摘除去勢(shì)手術(shù)建立的骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，模擬了這一疾病的生理?xiàng)l件和進(jìn)程，為目前國(guó)內(nèi)外篩選骨質(zhì)疏松藥物和治療方案的首選動(dòng)物模型[10]。EPCs是一群具有增生能力和能夠分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的潛能干細(xì)胞， 能夠促進(jìn)損傷血管的再生，在機(jī)體損傷修復(fù)過(guò)程中扮演著不可缺少的角色，在特定條件下可以分化為多種細(xì)胞，因此成為近些年來(lái)干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)，并且取得了令人矚目的成績(jī)[6,11]。最近相關(guān)研究[12]表明EPCs還具有分化為造血細(xì)胞和成骨細(xì)胞的能力。同時(shí)臨床研究[13]表明老年人骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量與骨密度成顯著正相關(guān),表明內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)骨組織新陳代謝可能有正調(diào)控作用，能夠有效提高老年人的骨量，減輕骨質(zhì)疏松。由此可以推測(cè)若通過(guò)靜脈移植EPCs、提高體內(nèi)成骨細(xì)胞的數(shù)量，可能對(duì)骨質(zhì)疏松發(fā)揮治療作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠去勢(shì)建立骨質(zhì)疏松模型后，經(jīng)EPCs尾靜脈移植進(jìn)行干預(yù)。研究結(jié)果顯示移植后13周，與模型組相比，EPCs組大鼠血清25(OH)D、BAP水平升高，25(OH)D、BAP為成骨細(xì)胞活性增加的重要標(biāo)志，表明EPCs移植后促進(jìn)了骨質(zhì)生成;CTX-I、TRAP5b的表達(dá)出現(xiàn)降低，CTX-I、TRAP5b為骨吸收主要標(biāo)志物，表明EPCs移植后骨吸收減少。本研究顯示模型組骨密度和骨鈣含量較假手術(shù)組明顯降低，表明大鼠骨質(zhì)疏松造模成功。EPCs移植組骨密度和骨鈣含量較模型組明顯升高，說(shuō)明EPCs移植對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠有治療作用。生物力學(xué)檢測(cè)表明，模型組極限載荷、極限應(yīng)力和彈性模量明顯低于假手術(shù)組，EPCs組的極限載荷和彈性模量比模型組有顯著增高。進(jìn)一步在基因蛋白水平對(duì)大鼠椎骨TGF-β/Smads信號(hào)通路的檢測(cè)顯示，EPCs組TGF-β1及Smad2/3的表達(dá)，與模型組相比顯著升高，與假手術(shù)組相近，表明EPCs大鼠尾靜脈移植能夠?qū)β殉补琴|(zhì)疏松大鼠起到有效的治療作用。

綜上，EPCs移植可能通過(guò)調(diào)控TGF-β/Smads通路發(fā)揮治療去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的作用。