鄒曉靜, 郝燕燕△, 胡一迪, 謝燊俠, 白 薇
(溫州市中醫(yī)院 1檢驗(yàn)科,2甲乳外科,浙江溫州325000)
乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤,目前治療主要 以手術(shù)結(jié)合放化療為主,但化療易耐藥及放射不敏感是困擾臨床的重要問(wèn)題[1],因此尋找有效治療乳腺癌的藥物及增強(qiáng)放化療敏感性的藥物是目前研究的重點(diǎn)。研究表明,中藥治療乳腺癌具有毒副作用小、效果好等特點(diǎn),對(duì)乳腺癌的預(yù)防效果顯著,且一些中藥對(duì)腫瘤細(xì)胞具有放療增敏的效果[2]。白頭翁是一種中草藥,具有抗腫瘤、抗氧化及促進(jìn)免疫等作用[3]。且研究報(bào)道白頭翁皂苷D體外可誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡[4];白頭翁皂苷A(Pulsatilla saponin A)可抑制人非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng),增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放射敏感性[5]。此外,微小RNA(microRNA,miRNA,miR)也與腫瘤的發(fā)展和放療敏感性相關(guān),如miR-24-3p可增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性[6],miR-24-3p可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲[7-8]。然而白頭翁皂苷A在體外對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及放射敏感性的影響還尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究擬探討白頭翁皂苷A對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞放射敏感性的影響及其機(jī)制是否與miR-24-3p有關(guān)。
人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清和DMEM培養(yǎng)液(Gibco);RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa);Taq DNA Polymerase和AceQ qPCR SYBR?Green Mix(Vazyme);LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen);MTT、蛋白提取試劑盒和BCA試劑盒(上海碧云天公司);白頭翁皂苷A(湖北萬(wàn)得化工有限公司);miR-NC、miR-24-3p、anti-miR-NC和anti-miR-24-3p載體質(zhì)粒(上海吉瑪生物公司)。[60Co]醫(yī)療照射裝置(中國(guó)核動(dòng)力研究院)。
稱取白頭翁皂苷A 0.668g,加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液33.4 mL,配成濃度為20 mg/L的儲(chǔ)存液,攪拌均勻后,抽濾無(wú)菌培養(yǎng),-20℃避光保存,使用時(shí)按所需濃度按比例稀釋。
3.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)。每2~3 d傳代一次。
3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 參考彭超軍[5]的實(shí)驗(yàn)方法,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化后,接種于96孔板(每孔1×104個(gè))培養(yǎng),DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后,吸去原培養(yǎng)液,換成終濃度分別為0、5、10、15和20 mg/L的白頭翁皂苷A的DMEM培養(yǎng)液,記為不同濃度白頭翁皂苷A處理組。不添加白頭翁皂苷A的作為對(duì)照組,以終濃度為10 mg/L的白頭翁皂苷A培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞,記作白頭翁皂苷A組。
取常規(guī)培養(yǎng)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞消化后接種于6孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合,更換為無(wú)血清培養(yǎng)液同步化12 h,隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將miR-NC、miR-24-3p、anti-miR-NC和anti-miR-24-3p質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至乳腺癌MCF-7細(xì)胞中,記為miR-NC組、miR-24-3p組、anti-miR-NC組和anti-miR-24-3p組,轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作。
取部分anti-miR-NC組和anti-miR-24-3p組的細(xì)胞分別加10 mg/L的白頭翁皂苷A培養(yǎng)48 h,記為白頭翁皂苷A+anti-miR-NC組和白頭翁皂苷A+antimiR-24-3p組。
3.3 MTT法測(cè)定白頭翁皂苷A對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞活力的影響 取以上各組細(xì)胞,在其培養(yǎng)至48 h時(shí)每孔加入20μL質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT試劑,繼續(xù)孵育4 h,加入150μL的DMSO,震蕩混勻,在酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度(A450)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔取均值,將對(duì)照組細(xì)胞抑制率設(shè)定為0%。其余各組細(xì)胞抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A/空白對(duì)照組A)×100%。
3.4 集落形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照組、白頭翁皂苷A組、白頭翁皂苷A+anti-miR-NC組、白頭翁皂苷A+antimiR-24-3p組、miR-NC組和miR-24-3p組細(xì)胞,分別給予0、2、4、6和8 Gy的[60Co]照射。照射后,按照射劑量大小分別以 0.3×103、1×103、1×103、3×103和 3×103的細(xì)胞密度接種于60 mm的培養(yǎng)皿中,繼續(xù)培養(yǎng)10~14 d。PBS清洗2遍后甲醇固定15 min,吉姆薩染色30 min,在低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的集落。平板效率(plating efficiency,PE;%)=集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。存活分?jǐn)?shù)(survial fraction,SF)=照射劑量組集落數(shù)(/該組細(xì)胞接種數(shù)×未照射組PE)。采用多靶單擊模型擬合細(xì)胞存活曲線,SF=1-(1-e-D/D0)N,Dq=D0×ln N。其中D為照射劑量(Gy),D0為平均致死劑量,Dq為準(zhǔn)閾劑量(代表存活的寬肩度),N為外推值。放射增敏比(sensitization enhancement ratio,SER)=單純照射組D0/加藥聯(lián)合照射組D0。
3.5 RT-qPCR分析miR-24-3p和環(huán)指蛋白2(ring finger protein 2,RNF2)的mRNA表達(dá)水平 按照TRIzol說(shuō)明書提取總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照AceQqPCR SYBR?Green Mix說(shuō)明書進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。循環(huán)條件為:95℃30 s,60℃30 s,72℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán);60℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
3.6 Western blot檢測(cè)RNF2蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞蛋白,用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。各組蛋白上樣量60μg,SDS-PAGE后,經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min,分別加入相應(yīng)的Ⅰ抗,4℃孵育過(guò)夜,PBS洗滌3次,每次5 min;再加入相對(duì)應(yīng)的Ⅱ抗室溫孵育2 h,PBS洗滌3次,每次10 min,暗室中顯影,定影。采用Quantity One凝膠分析軟件處理,測(cè)定各組蛋白條帶的A值,以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
3.7 螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-24-3p對(duì)RNF2的靶向調(diào)控 TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)顯示RNF2的3′-UTR有miR-24-3p的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建野生型和突變型RNF2的3′-UTR螢光素酶表達(dá)載體(WT-RNF2和MUT-RNF2),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞接種于24孔板(每孔1×103個(gè)),待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí),用LipofectamineTM2000將WT-RNF2和MUT-RNF2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞,同時(shí)分別轉(zhuǎn)染miR-24-3p和miR-NC。依據(jù)說(shuō)明書要求,使用螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)儀進(jìn)行雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
采用GraghPad Prism 5擬合細(xì)胞存活曲線。采用SPSS 20.00進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩組比較行t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
用不同濃度的白頭翁皂苷A處理乳腺癌MCF-7細(xì)胞48 h后,乳腺癌MCF-7細(xì)胞的活力抑制率隨著白頭翁皂苷A的濃度升高而顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表1。白頭翁皂苷A的濃度為10 mg/L時(shí),細(xì)胞活力抑制率為50%左右,因此我們將10 mg/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用藥濃度。
集落形成實(shí)驗(yàn)后,通過(guò)多靶單擊模型擬合計(jì)算得出,在MCF-7細(xì)胞中對(duì)照組和白頭翁皂苷A組的D0值分別是2.846和1.517,白頭翁皂苷A的SER是1.876,見(jiàn)表2。細(xì)胞存活擬合曲線顯示,在同一劑量照射下,白頭翁皂苷A聯(lián)合照射組的SF小于單純照射對(duì)照組,存活曲線下移(P<0.05),見(jiàn)圖1。
表1 不同濃度的白頭翁皂苷A對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的影響Table 1.Effect of different concentrations of Pulsatilla saponin A on viability of MCF-7 cells(Mean±SD.n=9)
表2 對(duì)照組和白頭翁皂苷A組的多靶單擊模型參數(shù)Table 2.The parameters of multitarget single-hit model in control and Pulsatilla saponin A groups.
Figure 1.Survival curve of MCF-7 cells after different doses of irradiation.Mean±SD.n=9.*P<0.05 vs control group.圖1 不同劑量照射后MCF-7細(xì)胞的存活曲線
相較于對(duì)照組,白頭翁皂苷A組中miR-24-3p的表達(dá)水平顯著升高,RNF2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖2、表3。
Figure 2.RNF2 protein electropherogram of control and Pulsatilla saponin A groups.圖2 對(duì)照組和白頭翁皂苷A組的RNF2蛋白電泳圖
表3 白頭翁皂苷A對(duì)MCF-7細(xì)胞中miR-24-3p和RNF2表達(dá)的影響Table 3.Effect of Pulsatilla saponin A on expression of miR-24-3p and RNF2 in MCF-7 cells(Mean±SD.n=9)
通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到RNF2與miR-24-3p存在結(jié)合位點(diǎn),見(jiàn)圖3A。螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-RNF2的MCF-7細(xì)胞中,miR-24-3p組的螢光素酶活性較于miR-NC組顯著降低(P<0.05);而轉(zhuǎn)染MUT-RNF2的細(xì)胞中,兩組的螢光素酶活性無(wú)顯著差異,見(jiàn)表4。相較于miR-NC組,miR-24-3p組MCF-7細(xì)胞中RNF2蛋白的表達(dá)顯著降低;而相較于anti-miR-NC組,anti-miR-24-3p組MCF-7細(xì)胞中RNF2蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05),見(jiàn)圖3B及表5。*P<0.05vsmiR-NCgroup.*P<0.05vsmiR-NCgroup;#P<0.05vsanti-miR-NCgroup.
Figure 3.miR-24-3p targeted RNF2 and regulated its expression.A:the 3′UTRof RNF2 contains a nucleotide sequence complementary to miR-24-3p;B:RNF2 protein electropherogram.圖3 miR-24-3p靶向調(diào)控RNF2的表達(dá)
表4 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果Table 4.The results of dual-luciferase reporter assay(Mean±SD.n=9)
表5 miR-24-3p調(diào)控RNF2蛋白的表達(dá)Table 5.miR-24-3p regulated the expression of RNF2 protein(Mean±SD.n=9)
相較于miR-NC組,miR-24-3p組MCF-7細(xì)胞中miR-24-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),且細(xì)胞活力的抑制率顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表6。集落形成實(shí)驗(yàn)后,通過(guò)多靶單擊模型擬合計(jì)算得出,miR-NC組和miR-24-3p組的D0值分別是2.267和1.370,miR-24-3p過(guò)表達(dá)的SER是1.655,見(jiàn)表7。細(xì)胞存活擬合曲線顯示,在同一劑量照射下,miR-24-3p組的SF顯著小于miR-NC組,存活曲線顯著下移(P<0.05),見(jiàn)圖4。
表7 miR-NC組和miR-24-3p組的多靶單擊模型參數(shù)Table 7.The parameters of multitarget single-hit model in miRNCand miR-24-3p groups
相較于白頭翁皂苷A+anti-miR-NC組,白頭翁皂苷A+anti-miR-24-3p組MCF-7細(xì)胞中miR-24-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),RNF2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),且細(xì)胞活力的抑制率顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖5及表8。
Figure 4.Effect of miR-24-3p overexpression on radiosensitivity of MCF-7 cells.Mean±SD.n=9.*P<0.05 vs miR-NC group.圖4 miR-24-3p過(guò)表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞放射敏感性的影響
Figure 5.RNF2 protein electropherogramof different groups.圖5 各組RNF2蛋白電泳圖
表8 抑制miR-24-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了白頭翁皂苷A對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的作用Table 8.Inhibition of miR-24-3p expression reversed the effect of Pulsatilla saponin A on viability of MCF-7 cells(Mean±SD.n=9)
集落形成實(shí)驗(yàn)后,通過(guò)多靶單擊模型擬合計(jì)算得出,白頭翁皂苷A組和白頭翁皂苷A+anti-miR-24-3p組的SER分別是1.766和0.603,見(jiàn)表9。細(xì)胞存活擬合曲線顯示,在同一劑量照射下,白頭翁皂苷A+anti-miR-24-3p組的SF大于白頭翁皂苷A+antimiR-NC組,存活曲線上移(P<0.05),見(jiàn)圖6。
近年來(lái)研究表明,中醫(yī)藥可以減輕放化療帶來(lái)的毒副反應(yīng),且可提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性[9]。中藥白頭翁中提取的有效成分皂苷具有體外抗腫瘤作用[10],如白頭翁皂苷A可以通過(guò)調(diào)控Bcl-2、cyclin B1等蛋白的表達(dá)促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡[11]。在急性白血病中,白頭翁皂苷A可誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化;還可誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞系(K562、U937及HL-60細(xì)胞)及其原代細(xì)胞向更成熟的粒系分化[12]。白頭翁皂苷A可增強(qiáng)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放射敏感性[5]。白頭翁皂苷D通過(guò)抑制AKT/mTOR信號(hào)通路可抑制結(jié)腸癌腫瘤的血管生成,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13];而抑制PI3K通過(guò)降低AKT活性可提高M(jìn)CF-7細(xì)胞對(duì)放射的敏感性[14]。以上結(jié)果表明,白頭翁皂苷不僅具有抗腫瘤作用,還能增加癌細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,白頭翁皂苷A可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖,且增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的放射敏感性。與先前研究報(bào)道相符。
表9 各組多靶單擊模型參數(shù)Table 9.The parameters of multitarget single-hit model in different groups
Figure 6.Inhibition of miR-24-3p expression reversed the effect of Pulsatilla saponin A on radiosensitivity of MCF-7 cells.Mean±SD.n=9.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs Pulsatilla saponin A+anti-miR-NCgroup.圖6 抑制miR-24-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了白頭翁皂苷A對(duì)MCF-7細(xì)胞放射敏感性的作用
miRNA不僅參與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,還與細(xì)胞放射敏感性相關(guān)。miR-24-3p在膀胱癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤組織中下調(diào)表達(dá),過(guò)表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[15-16]。miR-24-3p通過(guò)靶向SOX7促進(jìn)肺癌中的細(xì)胞遷移和增殖[17]。miR-24-3p通過(guò)靶向下調(diào)PRKCH可抑制腺樣囊性癌細(xì)胞的活力、增殖、遷移、侵襲等[18]。過(guò)表達(dá)miR-24通過(guò)靶向SP1能增強(qiáng)鼻咽癌的放射敏感性[19]。既往研究表明miR-24-3p在MCF-7細(xì)胞中下調(diào)表達(dá),促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲,進(jìn)而影響乳腺癌預(yù)后[7]。本研究表明,過(guò)表達(dá)miR-24-3p可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖,與前人研究相符,且過(guò)表達(dá)miR-24-3p增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的放射敏感性。
miRNA可通過(guò)調(diào)控其靶基因發(fā)揮多種生物學(xué)作用[20-21]。研究顯示,RNF2在乳腺癌組織中高表達(dá),是一種癌基因[22]。沉默RNF2可能通過(guò)上調(diào)Bax以及下調(diào)cyclin D2、cyclin依賴性激酶4和Bcl-2誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0/G1期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,從而增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的放射敏感性[23];下調(diào)RNF2還可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng),增強(qiáng)U87細(xì)胞對(duì)放射的敏感性[24]。本研究表明,miR-24-3p靶向下調(diào)RNF2的表達(dá),且白頭翁皂苷A促進(jìn)miR-24-3p的表達(dá),抑制RNF2的表達(dá)。這提示白頭翁皂苷A可能通過(guò)調(diào)控miR-24-3p/RNF2影響乳腺癌細(xì)胞的增殖及放射敏感性。
綜上所述,白頭翁皂苷A在體外具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、增強(qiáng)其放射敏感性的作用。這些作用可能是通過(guò)上調(diào)miR-24-3p、下調(diào)RNF2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。