鄧春艷， 王晗月， 李 寧， 蔣豆蔻， 俞麗娜， 歐陽(yáng)志斌， 李富榮△

［暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（深圳市人民醫(yī)院）1生物治療室，2轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，深圳市干細(xì)胞研究與臨床轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518020；3暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，廣東廣州510632］

據(jù)世界衛(wèi)生組織最新公布數(shù)據(jù)顯示，糖尿病已成為緊隨心腦血管疾病和惡性腫瘤之后的第3大疾病。盡管糖尿病患者可以通過(guò)補(bǔ)充胰島素非常有效地控制血糖，但與健康患者相比，接受治療的患者總體預(yù)期壽命縮短、生活質(zhì)量改善，因此目前的研究主要是利用多種方法來(lái)產(chǎn)生功能完整的胰島素分泌細(xì)胞（insulin-producing cells，IPCs）［1］。干細(xì)胞在一定條件下能誘導(dǎo)分化為IPCs，已經(jīng)逐漸成為人們尋找胰島β細(xì)胞替代物的新資源［2］。但是，體外干細(xì)胞（包括胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和成體干細(xì)胞）分化為胰島β細(xì)胞效率低、成熟度差的問(wèn)題限制著臨床應(yīng)用。

近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA，miRNA，miR）在干細(xì)胞自我更新和分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，調(diào)控某種特異性miRNA表達(dá)，可以促進(jìn)干細(xì)胞向特定組織細(xì)胞的定向分化［3］。miR-375在人類和小鼠的胰島中是表達(dá)最強(qiáng)的一種miRNA，對(duì)胰島β細(xì)胞的成熟具有重要的作用［4］。miR-375前體經(jīng)過(guò)在5′端和3′端的加工處理后可以形成miR-375-5p和miR-375-3p兩個(gè)成熟的miRNAs，目前miR-375-5p的功能尚不明確，多數(shù)研究中證實(shí)的對(duì)胰島發(fā)育具有重要調(diào)控作用的是miR-375-3p。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建miR-375-3p過(guò)表達(dá)體系，探討miR-375過(guò)表達(dá)對(duì)人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）向 IPCs分化的影響及可能機(jī)制。

材料和方法

1 材料及試劑

hiPSCs系NF1-4-iPS-C11為中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院惠贈(zèng)，它是通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染OCT4、SOX2、c-Myc和Klf4基因?qū)肴似つw成纖維細(xì)胞重編程而產(chǎn)生的；人胰腺細(xì)胞系HPC-Y5來(lái)源于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。mTeSRTM1培養(yǎng)基購(gòu)自STEMCELL Technologies；Matrigel購(gòu)自BD；胰酶購(gòu)自Hy-Clone；誘導(dǎo)分化過(guò)程中使用的DMEM/F12、F12、IMDM、DMEM/H、ITS-X supplement、B-27 supplement和N-2 supplement均購(gòu)自Gibco；wortmannin購(gòu)自Selleck；nicotinamide、exendin-4和retinoic acid（RA）購(gòu)自Sigma；抗堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、骨形成蛋白 4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）、胰島素和C肽抗體購(gòu)自PeproTech；總RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自Life；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT reagent Kit和real-time PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMII購(gòu)自TaKaRa；One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit和SPoly（T）plus miRNA qPCR-assay primer set購(gòu)自深圳市盎然生物科技有限公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自 Invitrogen；Dual-Luciferase?Reporter（DLRTM）Assay System購(gòu)自Promega。

2 主要方法

2.1 hiPSCs的培養(yǎng) 采用無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)方式，hiPSCs生長(zhǎng)在Matrigel包被的培養(yǎng)皿中，用mTeSRTM1培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天更換新鮮的培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞鋪板率達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。

2.2 過(guò)表達(dá)miR-375的hiPSCs系的建立 采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成miR-375-3p的引物（5′-CGCCGCGGCCGCCGACGTGTCAGC-3′和 5′-GACTGCGGCCGCACAGCCTCTCCCACCCGTACGG-3′），PCR擴(kuò)增片段后克隆至慢病毒載體CV130-SV40-puromycin，引物的合成及慢病毒原液的制備均由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成，同時(shí)構(gòu)建空載體對(duì)照組。

2.3 hiPSCs的體外誘導(dǎo)分化 干細(xì)胞向IPCs分化的經(jīng)典誘導(dǎo)方法參照文獻(xiàn)［5］。第1階段（第0～4天）：誘導(dǎo)液為DMEM/F12中添加0.2%BSA、0.5×N-2 supplement、0.5× B-27 supplement、100 μg/L activin A和1μmol/L wortmannin，每天更換新鮮誘導(dǎo)液，連續(xù)誘導(dǎo)4 d；第2階段（第4～8天）：誘導(dǎo)液為F12與IMDM以1∶1比例混合，添加0.5%BSA、0.5× ITS-X supplement、0.5× B-27 supplement、2 μmol/L RA、20 μg/L FGF7和50μg/L Noggin，混合均勻，每天更換新鮮誘導(dǎo)液，連續(xù)誘導(dǎo)4 d；第3階段（第8～13天）：誘導(dǎo)液為DMEM/H中添加0.5%BSA、1×ITS-X supplement、1× N-2 supplement和50 μg/L EGF，混合均勻，每天更換新鮮誘導(dǎo)液，連續(xù)誘導(dǎo)5 d；第4階段（第13～21天）：誘導(dǎo)液為 DMEM/F12中添加 1× ITS-X supplement、10 μg/L bFGF、50 μg/L exendin-4、10 μg/L BMP4和10 mmol/L nicotinamide，混合均勻，每天更換新鮮誘導(dǎo)液。實(shí)驗(yàn)分為hiPSCs組（正常hiPSCs組）、miR-375-hiPSCs組（miR-375過(guò)表達(dá)組）和NeghiPSCs組（空載體對(duì)照組），各組細(xì)胞均按照上述方法進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)期間收集各組第0、7、14和21天的細(xì)胞用于后續(xù)監(jiān)測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)及C肽抗體染色檢測(cè)各誘導(dǎo)階段的分化效率。誘導(dǎo)結(jié)束采用免疫熒光染色檢測(cè)胰島素蛋白表達(dá)。通過(guò)體外葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)ELISA試劑盒測(cè)定誘導(dǎo)的IPCs釋放的胰島素和C肽含量來(lái)評(píng)估成熟度，并與人胰腺細(xì)胞系HPC-Y5來(lái)源的正常胰島細(xì)胞對(duì)比。

2.4 S-Poly（T）plus RT-qPCR法檢測(cè)miRNA-375的表達(dá) 將待檢測(cè)細(xì)胞提取總RNA，按照TRIzol總RNA提取試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，測(cè)定純度和濃度后按照One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)建立反應(yīng)體系合成cDNA，按照S-Poly（T）Plus miRNA qPCR-assay說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系檢測(cè) miR-375（hsa-miR-375-3p，編號(hào) MIMAT0000728，序列為 5′-UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA-3′），以SNORD44為內(nèi)參照，反應(yīng)條件為：95℃ 3 min；95℃10 s，60℃ 30 s，40 cycles。以第0天的正常 hiPSCs作為對(duì)照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-375的相對(duì)表達(dá)水平。

2.5 real-time PCR法檢測(cè)各階段標(biāo)志性基因的表達(dá) 誘導(dǎo)期間收集的各組細(xì)胞，按照TRIzol總RNA提取試劑的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA的提取，測(cè)定純度和濃度后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)建立反應(yīng)體系合成cDNA并完成real-time PCR檢測(cè)（引物序列見(jiàn)表1），動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)各組hiPSCs分化為胰腺β細(xì)胞的過(guò)程中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Pdx1、Pax6、Nkx6.1、MafA、insulin、glucokinase和HNF4α的表達(dá)變化，以GAPDH為內(nèi)參照，反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 35 s，40 cycles。以第0天的正常hiPSCs作為對(duì)照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers used for real-time PCRanalysis

2.6 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 采用生物信息學(xué)軟件（miRDB和TargetScan）預(yù)測(cè)miR-375可能的靶基因，構(gòu)建含靶基因3′端非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′UTR）序列的螢光素酶報(bào)告基因載體和含miR-375的表達(dá)質(zhì)粒，將兩者共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過(guò)化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)螢光素酶的活性，若活性降低，則通過(guò)驗(yàn)證；如果驗(yàn)證正確，則構(gòu)建含有miRNA突變靶位點(diǎn)的螢光素酶報(bào)告基因載體，再次進(jìn)行驗(yàn)證。

2.7 miR-375-hiPSCs中靶基因表達(dá)水平的檢測(cè)分別采用real-time PCR（方法同前）和Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中靶基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平，驗(yàn)證調(diào)控是否發(fā)生在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平。Western blot方法如下：各組細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解液裂解，提取總蛋白，BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度后定量，加等量蛋白于加樣孔中，順序完成電泳、半干法轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉、I抗孵育及洗膜、II抗孵育及洗膜、顯色，βactin作為內(nèi)參照，顯影之后Quantiy One軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理采用SPSS 19.0軟件。所有數(shù)據(jù)分析采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 過(guò)表達(dá)miR-375的hiPSCs系的構(gòu)建

將過(guò)表達(dá)miR-375的慢病毒和陰性對(duì)照病毒分別感染hiPSCs，嘌呤霉素篩選5 d后收取miR-375-hiPSCs和 Neg-hiPSCs的樣本，S-Poly（T）plus RT-qPCR法檢測(cè)miR-375的表達(dá)水平。Neg-hiPSCs與較未轉(zhuǎn)染的hiPSCs相比miR-375表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），miR-375-hiPSCs的miR-375表達(dá)水平較Neg-hiPSCs提高約10倍（P＜0.05），見(jiàn)圖1A。

2 IPCs的分化效率及成熟度

IPCs誘導(dǎo)結(jié)束后，免疫熒光檢測(cè)miR-375-hiPSCs組和空載體組胰島功能標(biāo)志性蛋白胰島素的表達(dá)和定位。結(jié)果顯示，胞漿內(nèi)可見(jiàn)胰島素表達(dá)，且miR-375-hiPSCs組的表達(dá)率顯著高于空載體組，見(jiàn)圖1B。

Figure 1.The expression of miR-375 in different hiPSCs groups（A）and the expression of insulin in induced miR-375-hiPSCs and Neg-hiPSCs into IPCs（B；21 d after induction，×200）.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs control group.圖1 不同組別hiPSCs中miR-375的表達(dá)及hiPSCs向IPCs分化后胰島素蛋白的表達(dá)

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，對(duì)照hiPSCs和NeghiPSCs經(jīng)四步法誘導(dǎo)21 d分化為IPCs，C肽陽(yáng)性率分別約為（22.5±2.9）%和（23.6±3.4）%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），miR-375-hiPSCs組的C肽陽(yáng)性率提高至（38.6±3.8）%，較上述兩對(duì)照組顯著增加（P＜0.01），見(jiàn)圖2A。

miR-375-hiPSCs經(jīng)21 d誘導(dǎo)分化后，將誘導(dǎo)分化的IPCs與成年胰島細(xì)胞進(jìn)行葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)，采用ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清中釋放的胰島素與C肽含量來(lái)評(píng)估成熟度。在低糖（2.5 mmol/L）和高糖（27.5 mmol/L）刺激下，對(duì)照hiPSCs和Neg-hiPSCs組分化的IPCs釋放的胰島素和C肽含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），與miR-375-hiPSCs組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低、高糖刺激下，hiPSCs組和Neg-hiPSCs組分化的IPCs釋放的胰島素和C肽僅為成年胰島細(xì)胞釋放量的1/8，而miR-375-hiPSCs分化的IPCs釋放的胰島素和C肽含量為成年胰島細(xì)胞釋放量的1/5，見(jiàn)圖2B、C。

Figure 2.The efficiency and maturity of differentiated IPCs from hiPSCs.A：flow cytometric results of C-peptide-positive cells in each group；Band C：the insulin and C-peptide secretion of the differentiated IPCs in each group was compared with that of the adult isletβ cells after glucose tolerance test.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs control group；##P＜0.01 vs adult islet group.圖2 誘導(dǎo)分化的IPCs的效率和成熟度檢測(cè)結(jié)果

3 miR-375-hiPSCs分化過(guò)程中基因表達(dá)的變化

對(duì)細(xì)胞分化過(guò)程中miR-375進(jìn)行監(jiān)測(cè)：顯示在誘導(dǎo)過(guò)程第0、7、14和21天，3組hiPSCs（control、NeghiPSCs和miR-375-hiPSCs）中miR-375的表達(dá)均逐漸升高，miR-375-hiPSCs組升高最明顯，與control和Neg-hiPSCs組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而Neg-hiPSCs與control之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖3A。此結(jié)果證明，分化過(guò)程中miR-375在miR-375-hiPSCs組細(xì)胞中高效過(guò)表達(dá)。

動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)hiPSCs分化為IPCs過(guò)程中胰腺β細(xì)胞發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)miR-375-hiPSCs組在誘導(dǎo)分化的第7天開(kāi)始，HNF4α、Pdx1、Pax6和Nkx6.1的表達(dá)水平迅速增加，其中Pdx1的表達(dá)在第14天達(dá)到最高峰，隨后略有下降，但仍維持在較高水平，其余均在第21天達(dá)最高峰；glucokinase、MafA及insulin的表達(dá)在第0、7和14天均維持在較低水平，第21天迅速達(dá)到最高峰；control組和Neg-hiPSCs組在經(jīng)典四步法誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上雖然也表現(xiàn)出相應(yīng)的變化趨勢(shì)，但表達(dá)量明顯低于miR-375-hiPSCs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3B～H。這些結(jié)果提示miR-375過(guò)表達(dá)促進(jìn)了hiPSCs向IPCs分化過(guò)程中β細(xì)胞發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。

Figure 3.The gene expression changes during differentiation in different hiPSCs groups.A：the expression of miR-375 during differentiation at different time points；B～H：the mRNA expression of genes related to the development of pancreaticβ cells during differentiation at different time points.Data were normalized to normal hiPSCs in control group at Day 0.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs control group at the same time point.圖3 不同組別hiPSCs分化過(guò)程中基因表達(dá)的變化

4 miR-375靶基因的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

TargetScan軟件分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-375可能的靶基因中與胰腺發(fā)育相關(guān)的包括：抑制元件1沉默轉(zhuǎn)錄因子（repressor element-1-silencing transcription factor，REST；又稱神經(jīng)元限制性沉默因子，即neuron restrictive silencer factor，NRSF）和無(wú)翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員5A（wingless type MMTV integration site family，member 5A，WNT5A)，其 mRNA 的3′UTR可與miR-375成熟序列的堿基互補(bǔ)配對(duì)，即REST和WNT5A很可能是miR-375的作用靶點(diǎn)之一。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，含有野生型質(zhì)粒的螢光素酶活性明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而含有突變型質(zhì)粒的螢光素酶活性的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，從結(jié)構(gòu)上證實(shí)了miR-375與靶基因REST和WNT5A的3′UTR的特異性結(jié)合，見(jiàn)圖4A、B。

5 miR-375-hiPSCs中靶基因的表達(dá)水平

real-time PCR結(jié)果顯示，hiPSCs與miR-375-hiPSCs中REST和WNT5A的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖4C；Western blot結(jié)果顯示，miR-375-hiPSCs中REST和WNT5A的蛋白表達(dá)水平較正常hiPSCs組明顯下降，見(jiàn)圖4D。上述結(jié)果提示，miR-375對(duì)靶基因REST和WNT5A的影響主要發(fā)生在翻譯水平，符合miRNA對(duì)靶基因抑制作用的特點(diǎn)。

Figure 4.Prediction and validation of miR-375 target genes.A：the predicted binding sites of miR-375 with RESTand WNT5A（the red labeled nucleotides were the mutation sites designed in luciferase reporter assay）；B：the relative luciferase activity of wild-type and mutant 3′UTR in 293T cells（NC：negative control）；C：real-time PCR results of REST and WNT5A；D：Western blot for determining the protein levels of REST and WNT5A（β-actin as internal control）.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs NCgroup；#P＜0.05 vs control group.圖4 miR-375靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證的結(jié)果

討 論

miRNA在胰腺發(fā)育、β細(xì)胞分化、胰島素分泌及葡萄糖代謝等方面都發(fā)揮著重要的作用［4］。miR-375特異性地表達(dá)于胰島細(xì)胞中，調(diào)控胰島胚胎發(fā)育過(guò)程及成熟胰島β細(xì)胞的功能，影響胰島素的合成與分泌，敲除miR-375的小鼠將發(fā)生胰島發(fā)育障礙［6］。胰腺發(fā)育過(guò)程中的兩個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子Pdx1和NeuroD1共同作用于miR-375的啟動(dòng)子及增強(qiáng)子來(lái)調(diào)節(jié)miR-375的表達(dá)［7］。研究證實(shí)在不添加各種細(xì)胞因子和小分子化合物的情況下，僅采取過(guò)表達(dá)miR-375的方式經(jīng)過(guò)21 d體外培養(yǎng)就可以分別將iPSCs或胚胎干細(xì)胞定向分化為IPCs，但分化效率和成熟度仍欠佳［8-9］；在脂肪干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-375后進(jìn)行誘導(dǎo)也能獲得更多表達(dá)胰島素和Pdx1的IPCs［10］。在前期工作中，課題組參考北京大學(xué)鄧宏魁教授建立的誘導(dǎo)方案［5］，通過(guò)添加各種細(xì)胞因子和小分子化合物建立了hiPSCs定向分化為胰島β細(xì)胞的方法，分化效率約22.3%。在此基礎(chǔ)上，本項(xiàng)目通過(guò)構(gòu)建慢病毒載體轉(zhuǎn)染miR-375至hiPSCs，過(guò)表達(dá)miR-375的hiPSCs結(jié)合經(jīng)典四步法向IPCs誘導(dǎo)分化的過(guò)程中，將有利于胰島β細(xì)胞標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子HNF4α、glucagon、Glut-2、Nkx6.1、Pdx1、Pax6、NeuroD和Isl-1的表達(dá)，明顯提高了分化效率及增強(qiáng)了成熟度上，但與正常成人胰島細(xì)胞功能仍存在一定差距。

生物信息學(xué)結(jié)合螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證REST和WNT5A為miR-375的靶基因，進(jìn)一步檢測(cè)顯示miR-375對(duì)REST和WNT5A的影響發(fā)生在蛋白質(zhì)翻譯水平，而非mRNA轉(zhuǎn)錄水平，符合miRNA對(duì)其靶基因抑制作用的特點(diǎn)。研究表明，REST蛋白參與調(diào)控胚胎干細(xì)胞的自我更新和全能性的維持，及干細(xì)胞的定向分化等多個(gè)生理過(guò)程［11］。一些對(duì)胰島素分泌起著重要調(diào)控作用的分子如突觸小體相關(guān)蛋白25（synaptosomal-associated protein 25，SNAP25）、突觸結(jié)合蛋白4（synaptotagmin 4，SYT4）和連接蛋白36（connexin 36）等，都已證實(shí)可以被REST負(fù)調(diào)控，因而REST的表達(dá)不存在于正常胰島β細(xì)胞中，胰島β細(xì)胞表達(dá)REST將減少胰島素的分泌［12-13］。Li等［14］的研究通過(guò)沉默REST基因?qū)⒀蛩蝎@得的干細(xì)胞成功誘導(dǎo)為胰島素分泌細(xì)胞；另有研究通過(guò)體外操控基因表達(dá)，即抑制REST和Shh基因，同時(shí)過(guò)表達(dá)Pdx1基因?qū)⑹蠊撬鐼SC分化為可感應(yīng)葡萄糖變化的IPCs，在他們的研究中抑制REST基因表達(dá)是必要的［15］。另一方面，WNT信號(hào)通路在胰腺發(fā)育的多個(gè)方面都至關(guān)重要，其不同層面的信號(hào)分子在胰腺組織中均有不同程度的表達(dá)［16］。研究提示在誘導(dǎo)hiPSCs向β細(xì)胞分化的過(guò)程中，添加WNT抑制劑獲得的細(xì)胞整體蛋白質(zhì)組學(xué)顯示出更類似于成人胰島的蛋白質(zhì)組學(xué)特征［17］；WNT5A可誘導(dǎo)大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞中鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II的活化，從而降低細(xì)胞穩(wěn)定性連環(huán)蛋白及其核轉(zhuǎn)位，最終降低細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)，成為抑制β細(xì)胞增殖的重要調(diào)控基因［18］。因此我們推測(cè)，miR-375有可能通過(guò)對(duì)REST和WNT5A的抑制，開(kāi)啟SNAP25、SYT4和connexin 36等與胰島素分泌相關(guān)的特異性基因，調(diào)控hiPSCs向IPCs分化。

然而，在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞分化是一個(gè)受到復(fù)雜、精確體系調(diào)控的有序規(guī)律過(guò)程。從分子水平看，這一結(jié)果取決于細(xì)胞在基因表達(dá)上的時(shí)空差異，是一個(gè)多基因通路綜合變化的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。無(wú)論是miR-375或其涉及的可能靶基因，在胰島β細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中都不是一成不變的，而是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程。研究提示miR-375在胚胎胰腺發(fā)育過(guò)程呈先高后低的表達(dá)規(guī)律，其表達(dá)水平在胚胎干細(xì)胞定向分化過(guò)程第5天達(dá)到高峰，然后開(kāi)始下降，直到分化結(jié)束［19］；同時(shí)，miR-375過(guò)度表達(dá)將抑制小鼠胰島β細(xì)胞中高糖誘發(fā)的胰島素分泌，內(nèi)源性miR-375的功能被抑制后可促進(jìn)胰島素分泌［20-21］；也有研究報(bào)道m(xù)iR-375上調(diào)可能增加胰島β細(xì)胞凋亡［22］。另一方面，WNT5A在胰腺細(xì)胞的遷移和框架的構(gòu)建中也發(fā)揮著積極的作用。盡管有研究提示W(wǎng)NT5A過(guò)表達(dá)會(huì)干擾胰島正常發(fā)育［23］，卻也有研究顯示在小鼠及斑馬魚(yú)等動(dòng)物胚胎模型中，WNT5A在胰島中廣泛表達(dá)，WNT5A-/-的小鼠中胰島素陽(yáng)性細(xì)胞的遷移會(huì)受到阻礙［24］；給予外源性WNT5A或過(guò)表達(dá)WNT5A均能抑制胰島星狀細(xì)胞生長(zhǎng)從而利于胰島素分泌［25］。這種看似矛盾的結(jié)果可能正好反映了基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性和精確性。因此，本研究采用過(guò)表達(dá)miR-375的hiPSCs結(jié)合經(jīng)典四步法向IPCs誘導(dǎo)分化的過(guò)程中，雖然在一定程度上能夠提高分化效率和成熟度，但未能完全實(shí)現(xiàn)分化過(guò)程中基因表達(dá)的精準(zhǔn)動(dòng)態(tài)調(diào)控，是形成局限的主要原因。

回顧過(guò)去的研究，干細(xì)胞用于糖尿病治療取得了令人鼓舞的成果，但是仍有許多問(wèn)題需要解決，如（1）干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中，除干細(xì)胞發(fā)育的微環(huán)境等因素外，控制干細(xì)胞高效定向分化為β細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)控因子仍不清楚；（2）干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化和體內(nèi)移植的安全性問(wèn)題；（3）如何大規(guī)模用干細(xì)胞產(chǎn)生胰島素分泌細(xì)胞。隨著研究的進(jìn)一步深入以及技術(shù)的提高和進(jìn)步，相信不久的將來(lái)，這些問(wèn)題都會(huì)被逐一解決，使干細(xì)胞臨床治療糖尿病成為可能。