高琳芝， 謝 云， 周 怡， 魏莉娜， 張 弛， 呂林艷，姚嘉慧， 梁曉燕， 劉貴華， 楊 星△

（1中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，廣東廣州510655；2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院男科，廣東廣州510080）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是最常見的育齡期女性排卵障礙疾病，嚴(yán)重影響女性生殖內(nèi)分泌功能，是導(dǎo)致年輕女性月經(jīng)紊亂、閉經(jīng)和不孕最常見的原因［1-2］。PCOS最主要的病理生理特點為卵泡膜細(xì)胞過度增生及卵巢雄激素合成增加所致高雄激素血癥［3］。雖然目前針對降低PCOS患者雄激素水平藥物已廣泛應(yīng)用于臨床，但這些藥物只能暫時性控制高雄激素血癥［2］。因此，了解PCOS的發(fā)病機(jī)制對于發(fā)現(xiàn)新的有效治療靶點至關(guān)重要。慢性亞急性炎癥狀態(tài)是導(dǎo)致PCOS患者高雄激素血癥的重要因素，而M1型巨噬細(xì)胞是參與形成PCOS患者體內(nèi)慢性炎癥的關(guān)鍵細(xì)胞，其在PCOS體內(nèi)堆積并分泌大量炎癥因子［4-6］。卵泡膜細(xì)胞是女性合成雄激素最重要的效應(yīng)細(xì)胞，PCOS患者卵泡膜細(xì)胞較正常對照增殖明顯，是導(dǎo)致PCOS雄激素合成增加的關(guān)鍵原因。多項研究表明M1型巨噬細(xì)胞通過分泌炎癥因子促進(jìn)雄激素合成并不能完全解釋PCOS患者M(jìn)1型巨噬細(xì)胞堆積對卵巢雄激素合成的影響［7］。因此，PCOS患者慢性炎癥狀態(tài)如何影響卵巢雄激素合成功能仍有待闡明。

外泌體（exosomes，Exo）是一種可由多種細(xì)胞主動分泌、直徑為30～150 nm的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)囊泡，近年來因其具有攜帶一系列生物分子如功能性蛋白質(zhì)及mRNA等進(jìn)行細(xì)胞或組織間遠(yuǎn)距交流的靶向調(diào)控能力而備受關(guān)注［8］。已有研究報道外泌體在PCOS發(fā)病中起重要作用［9］。相關(guān)研究提示使用細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激活化的M1型巨噬細(xì)胞能模擬機(jī)體慢性炎癥狀態(tài)，并通過分泌外泌體發(fā)揮靶向調(diào)控作用，是多種疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素［10］。然而，尚無研究M1型巨噬細(xì)胞來源外泌體在PCOS高雄激素血癥發(fā)生中作用和機(jī)制的報道。因此，我們假設(shè)M1型巨噬細(xì)胞分泌的外泌體可調(diào)節(jié)卵泡膜細(xì)胞的功能，研究來自M1型巨噬細(xì)胞分泌的外泌體對卵泡膜細(xì)胞活力的影響，并闡明其潛在的作用機(jī)制。

材料和方法

1 動物

SPF級昆明雌性小鼠，4周齡，由中山大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（粵）2016-0029。

2 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基和DPBS緩沖液均購自Gibco；胎牛血清購自AUSGENEX；脂多糖、外泌體熒光標(biāo)記PKH67試劑盒及外泌體分泌抑制劑GW4869購自Sigma；CCK-8試劑盒購自Dojindo；BCA蛋白濃度分析試劑盒和ECL顯影試劑盒購自Thermo；兔/鼠抗CD63、CD81、腫瘤易感基因101蛋白（tumor susceptibility gene 101 protein,TSG101）、鈣連蛋白（calnexin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1B（cyclin-dependent kinase inhibitor 1B，CDKN1B）單克隆抗體購自Abcam；細(xì)胞周期試劑盒購自凱基生物；引物由上海生工公司合成。

流式細(xì)胞儀和Optima XE-100型超高速低溫離心機(jī)（Beckman Coulter）；H-7650型生物性透射電鏡（Hitachi）；納米流式檢測儀（廈門福流生物科技有限公司）。

3 主要方法

3.1 巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7由CytoBiotech惠贈。采用含10%胎牛血清及1%青、鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱。采用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞構(gòu)建M1型炎性巨噬細(xì)胞，濃度為100μg/L。

3.2 卵泡膜細(xì)胞的提取、培養(yǎng)和鑒定 小鼠卵泡膜細(xì)胞的培養(yǎng)參考文獻(xiàn)中的方法［11-12］。收集卵巢于DPBS中，體式顯微鏡下去除卵巢旁組織，無菌穿刺針穿刺卵巢釋放卵泡液及顆粒細(xì)胞。DPBS沖洗卵巢組織，無菌剪刀剪碎卵巢至約1 mm×1 mm×1 mm碎片，轉(zhuǎn)移至含I型膠原酶（5 g/L）的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37℃水浴鍋中消化90 min，每10 min吹散組織碎片。消化結(jié)束后，使用40μm濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，去除未消化的組織碎片。DPBS清洗細(xì)胞懸液3次，使用1 mL DPBS重懸細(xì)胞，利用不連續(xù)密度梯度法純化卵泡膜細(xì)胞。吸取1 mL 50%Percoll梯度液于15 mL無菌離心管，1 mL 40%Percoll梯度液置于50%梯度液上層，細(xì)胞懸液置于40%梯度液上層，4℃下400×g離心20 min，純化后的卵泡膜細(xì)胞位于40%Percoll液層。使用DPBS清洗卵泡膜細(xì)胞懸液3次后，使用含10%胎牛血清及1%青、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸并接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

3.3 巨噬細(xì)胞與卵泡膜細(xì)胞共培養(yǎng) LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞在Transwell小室中孵育過夜，卵泡膜細(xì)胞以每孔3×104細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中，細(xì)胞貼壁后，將上述Transwell小室轉(zhuǎn)移至24孔板中，構(gòu)建巨噬細(xì)胞-卵泡膜細(xì)胞共培養(yǎng)體系。為了明確M1型巨噬細(xì)胞是否通過外泌體影響卵泡膜細(xì)胞的活力，使用10μmol/L GW4869預(yù)處理M1型巨噬細(xì)胞24 h，抑制其外泌體分泌。

3.4 Raw264.7巨噬細(xì)胞外泌體的提取 Raw264.7巨噬細(xì)胞生長至70%左右覆蓋時，DPBS清洗細(xì)胞2遍，換用無外泌體血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后，收集細(xì)胞上清，細(xì)胞正常傳代。將收集到的細(xì)胞上清液于4℃連續(xù)離心（依次為300×g10 min，4 000×g10 min，12 000×g30 min）以除去死細(xì)胞及細(xì)胞碎片；上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃、100 000×g離心70 min；收集試管底部沉淀，使用0.22μm過濾后的DPBS重懸沉淀，0.22μm的濾網(wǎng)過濾；再次4℃、100 000×g離心70 min，得到的沉淀物即為外泌體。一部分沉淀物用過濾后的DPBS重懸，-80℃保存用于電鏡觀察、納米流式檢測及小鼠體內(nèi)注射實驗；余下加入含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，提取外泌體總蛋白，-80℃保存用于后續(xù)Western blot實驗［13-14］。

3.5 Raw264.7巨噬細(xì)胞外泌體的鑒定 取上述實驗得到的外泌體樣品20μL，將樣品置于透射電子顯微鏡網(wǎng)格上室溫孵育2 min，再滴加3%磷鎢酸室溫靜置2 min，蒸餾水清洗網(wǎng)格，電子透射顯微鏡下觀察并拍照。取0.5 mL外泌體母液，1 mL超純水稀釋，用納米流式檢測儀對其粒徑進(jìn)行檢測。取出外泌體蛋白樣品，SDS-PAGE進(jìn)行分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉，加入抗CD63、calnexin、CD81和TSG101抗體及相應(yīng)的II抗，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

3.6 實驗分組 將穩(wěn)定培養(yǎng)的卵泡膜細(xì)胞分為2個處理組，分別為正常巨噬細(xì)胞源外泌體（MC-Exo）處理組和M1型巨噬細(xì)胞源外泌體（M1-Exo）處理組。2組均在細(xì)胞貼壁后采用相同體積的培養(yǎng)基培養(yǎng)，外泌體（30 mg/L）提取過程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，超速離心后得到的外泌體使用DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸。2組同時換相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

3.7 外泌體熒光標(biāo)記示蹤 上述超速離心法獲得的外泌體，用DPBS溶解后，加入PKH67混懸液中，充分重懸混勻，室溫靜置5 min染色，加入等體積無外泌體血清終止染色，再次4℃、100 000×g離心70 min，沉淀為PKH67標(biāo)記的外泌體，DPBS重懸后，再次超速離心，沉淀用培養(yǎng)基重懸后，并對卵泡膜細(xì)胞進(jìn)行換液處理。將PKH67熒光標(biāo)記的外泌體與24孔板內(nèi)接種的卵泡膜細(xì)胞共孵育24 h，孵育結(jié)束后，使用PBS稀釋的1%多聚甲醛固定卵泡膜細(xì)胞15 min，4℃條件下DAPI染色30 min，熒光顯微鏡下檢測各組細(xì)胞熒光強度。

3.8 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 卵泡膜細(xì)胞以每孔5×103密度接種于96孔，培養(yǎng)過夜至完全貼壁，每孔分別給予10μL外泌體PBS混懸液處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10μL CCK-8，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，450 nm波長處檢測各組吸光度（A）。

3.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布 取對數(shù)生長期卵泡膜細(xì)胞，接種于6孔板中，對照組加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入含外泌體的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，按照細(xì)胞周期檢測試劑盒操作說明書，PBS清洗細(xì)胞，以70%無水乙醇固定細(xì)胞過夜。固定結(jié)束后，PBS清洗固定液，加入500μL染色工作液，室溫避光孵育30～60 min。上機(jī)檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。

3.10 qPCR實驗 12孔板內(nèi)卵泡膜細(xì)胞按各組處理24 h后，采用TRIzol法進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取，根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)相應(yīng)操作對總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA。使用SYBR Green qPCR Kit進(jìn)行CDKN1B的qPCR檢測，以β-actin為內(nèi)參照。PCR步驟為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s、60℃退火延伸30 s、72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1. The sequences of theprimers for qPCR

3.11 Western blot實驗 6孔板內(nèi)卵泡膜細(xì)胞按各組處理24 h后，采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。BCA定量后，采用20μg蛋白上樣于15%分離膠下進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入抗CDKN1B抗體稀釋液，孵育過夜后，使用相應(yīng)的II抗孵育1 h，孵育結(jié)束后，化學(xué)發(fā)光顯影儀下顯影，采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值統(tǒng)計分析。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS22.0軟件分析。計量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD），兩組間均數(shù)比較采用Student'st檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠卵泡膜細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

小鼠卵泡膜細(xì)胞貼壁后呈紡錘形，折光性好。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，提取的細(xì)胞表達(dá)3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD），陽性率大于95%，見圖1。這表明我們成功提取了卵泡膜細(xì)胞，并能進(jìn)行后續(xù)研究。

Figure 1.Identification of the cultured theca cells by observing the immunofluorescence of 3β-HSD（×200）.圖1 卵泡膜細(xì)胞3β-HSD免疫熒光鑒定圖

2 M 1型巨噬細(xì)胞對卵泡膜細(xì)胞細(xì)胞活力的影響

為了明確M1型巨噬細(xì)胞是否影響卵泡膜細(xì)胞活力，我們在共培養(yǎng)系統(tǒng)中將LPS誘導(dǎo)后的M1型巨噬細(xì)胞與卵泡膜細(xì)胞共培養(yǎng)，同時使用外泌體分泌抑制劑GW4869預(yù)處理M1型巨噬細(xì)胞，抑制其外泌體的釋放。CCK-8實驗結(jié)果表明，共培養(yǎng)組卵泡膜細(xì)胞的活力增強，而在GW4869處理后，這一作用被消除，見圖2。

Figure 2.M1 macrophages enhanced the viability of theca cells.GW4869，a well-known inhibitor of exosome secretion，was used at a concentration of 10μmol/L to reduce the release of exosome from M1 macrophages.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs co-culture group；+P＜0.05 vs control group.圖2 M 1型巨噬細(xì)胞對卵泡膜細(xì)胞活力的影響

3 巨噬細(xì)胞來源外泌體的鑒定

我們利用超高速離心法提取巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的外泌體，將所提取的外泌體置于透射電鏡下觀察，可見大小均一的杯狀結(jié)構(gòu)，包膜完整，單個分布或聚集成群，粒徑大小在60 nm左右，見圖3A；納米流式檢測儀的結(jié)果顯示，所提取的外泌體平均粒徑為（69.4±19.4）nm，90%以上處于30～150 nm直徑范圍內(nèi)，見圖3B；Western blot結(jié)果顯示，所提取的外泌體含有CD63、CD81和TSG101這3種外泌體標(biāo)志蛋白，且不含calnexin，見圖3C。上述結(jié)果表明，M1型巨噬細(xì)胞分泌的外泌體被成功分離。

4 巨噬細(xì)胞分泌的外泌體能被卵泡膜細(xì)胞攝取

為了驗證巨噬細(xì)胞分泌的外泌體能否被卵泡膜細(xì)胞攝取，我們采用PKH67熒光標(biāo)記的巨噬細(xì)胞源外泌體與卵泡膜細(xì)胞共孵育24 h，熒光顯微鏡下拍照，結(jié)果顯示共培養(yǎng)組卵泡膜細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的PKH67綠色熒光，而對照組無熒光，見圖4。

5 M 1型巨噬細(xì)胞源外泌體對卵泡膜細(xì)胞活力的影響

將M1型巨噬細(xì)胞分泌的外泌體與卵泡膜細(xì)胞共孵育24 h，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，M1型巨噬細(xì)胞源外泌體處理組卵泡膜細(xì)胞的活力較對照組顯著增強（P＜0.05），見圖5。

6 M 1型巨噬細(xì)胞源外泌體對卵泡膜細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和CDKN1B表達(dá)的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，M1型巨噬細(xì)胞源外泌體處理組G0/G1期細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.05），S期細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05），見圖6。既往研究表明，M1型巨噬細(xì)胞源外泌體可通過調(diào)控CDKN1B的表達(dá)影響靶細(xì)胞的增殖能力［15］。我們通過qPCR及Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，M1型巨噬細(xì)胞源外泌體處理后的卵泡膜細(xì)胞CDKN1B的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05），見圖7。

Figure 3.The extraction and identification of exosomes（Exo）secreted by Raw264.7 macrophages（MC）.A：electron microscopic analysis（the scale bar=50 nm）；B：the size distribution of the exosomes detected by flow nanoanalyzer；C：the expression of exosome-specific markers CD63，CD81 and TSG101 measured by Western blot.圖3 Raw264.7巨噬細(xì)胞來源外泌體的提取與鑒定

Figure 4.Fluorescence microscopic observation of theca cells after incubation with PKH67-labeled macrophage-derived exosomes（×200）.圖4 卵泡膜細(xì)胞內(nèi)示蹤PKH67標(biāo)記的巨噬細(xì)胞源外泌體

討 論

Figure 5.The effects of exosomes secreted by M1 macrophages on the viability of theca cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs MC-Exo group.圖5 M 1型巨噬細(xì)胞源外泌體對卵泡膜細(xì)胞活力的影響

卵泡膜細(xì)胞對卵泡的發(fā)育及卵子成熟至關(guān)重要，且可調(diào)節(jié)卵巢甾體激素的合成，是卵巢雄激素合成的主要來源；卵泡膜細(xì)胞功能失調(diào)是PCOS患者高雄激素血癥的關(guān)鍵原因［2，16］。3β-HSD是卵泡膜細(xì)胞特異性表達(dá)的分子，我們采用梯度離心法分離純化得到的小鼠卵泡膜細(xì)胞95%以上表達(dá)3β-HSD蛋白，證實成功獲取小鼠卵泡膜細(xì)胞。慢性亞急性炎癥長期以來被認(rèn)為在PCOS的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，是卵巢卵泡膜細(xì)胞功能障礙繼而雄激素合成增加的主要原因；PCOS患者體內(nèi)慢性亞急性炎癥表現(xiàn)為局部組織M1型巨噬細(xì)胞堆積，伴隨炎癥因子分泌增加［12-13］。然而，M1型巨噬細(xì)胞導(dǎo)致卵泡膜細(xì)胞功能障礙的機(jī)制尚未被闡明。有研究表明使用LPS刺激巨噬細(xì)胞，可誘導(dǎo)產(chǎn)生形成體內(nèi)慢性炎性狀態(tài)的M1型巨噬細(xì)胞，模擬PCOS患者體內(nèi)的慢性炎癥狀態(tài)［14］。本研究根據(jù)此方法使用LPS刺激Raw264.7巨噬細(xì)胞構(gòu)建M1型慢性炎性巨噬細(xì)胞模型，用以模擬PCOS患者體內(nèi)的慢性炎癥狀態(tài)［17］。外泌體作為廣泛認(rèn)可的包裹多種生物學(xué)分子的細(xì)胞外囊泡，具有調(diào)控靶細(xì)胞的功能［18］。最近研究表明，巨噬細(xì)胞分泌的外泌體是其發(fā)揮靶向調(diào)控作用的關(guān)鍵途徑［19］。我們構(gòu)建了M1巨噬細(xì)胞-卵泡膜細(xì)胞共培養(yǎng)體系，并使用GW4869抑制巨噬細(xì)胞外泌體分泌，CCK-8實驗結(jié)果表明M1巨噬細(xì)胞通過外泌體增強卵泡膜細(xì)胞活性。進(jìn)一步使用超速離心法富集巨噬細(xì)胞分泌的外泌體，通過Western blot、電鏡及納米粒徑分析儀進(jìn)行鑒定，我們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞源外泌體具有典型的杯狀結(jié)構(gòu)，直徑在50～100 nm之間，且表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白CD63、CD81和TSG101等，提示成功提取巨噬細(xì)胞外泌體。

Figure 6.The effect of the exosomes derived from M1 macrophages on the cell cycle of theca cells was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs MC-Exo group.圖6 M1型巨噬細(xì)胞分泌的外泌體對卵泡膜細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響

Figure 7.The effects of the exosomes derived from M1 macrophages on the mRNA（A）and protein（B）expression levels of CDKN1B were detected by qPCR and Western blot，respectively.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs MC-Exo group.圖7 M 1型巨噬細(xì)胞分泌的外泌體對卵泡膜細(xì)胞CDKN1B表達(dá)水平的影響

既往研究認(rèn)為M1型巨噬細(xì)胞可能通過分泌炎癥因子，改變卵巢局部微環(huán)境進(jìn)而導(dǎo)致卵泡膜細(xì)胞功能障礙［4］。但是針對體內(nèi)炎癥因子的治療并不能有效控制高雄激素血癥，結(jié)合我們共培養(yǎng)實驗結(jié)果，提示M1型巨噬細(xì)胞可能通過外泌體途徑調(diào)控卵泡膜細(xì)胞功能。我們通過外泌體示蹤實驗發(fā)現(xiàn)，使用PKH67標(biāo)記的巨噬細(xì)胞源外泌體與卵泡膜細(xì)胞共培養(yǎng)后，卵泡膜細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)PKH67綠色熒光，提示巨噬細(xì)胞源外泌體可被卵泡膜細(xì)胞攝取。

卵泡膜細(xì)胞增生是 PCOS 重要的病理特征［2，20］。我們通過CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞源外泌體促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞的活力，提示PCOS患者體內(nèi)異?；罨腗1型巨噬細(xì)胞可能通過分泌外泌體促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞生長，參與PCOS發(fā)病過程。我們進(jìn)一步借助流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，與M1型巨噬細(xì)胞源外泌體共孵育后，卵泡膜細(xì)胞較對照組G0/G1期縮短，S期細(xì)胞相對增多，提示M1型巨噬細(xì)胞通過分泌外泌體促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。CDKN1B是細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKI）家族的成員，與細(xì)胞周期關(guān)系密切，可以阻斷細(xì)胞從G1期到S期［21］。本研究通過qPCR及Western blot實驗檢測組間CDKN1B表達(dá)水平的差異，發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞源外泌體抑制卵泡膜細(xì)胞CDKN1B的mRNA及蛋白表達(dá)。這提示M1型巨噬細(xì)胞源外泌體通過負(fù)向調(diào)控卵泡膜細(xì)胞CDKN1B的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。多項研究發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞源外泌體通過轉(zhuǎn)運miRNA、mRNA等，調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響靶細(xì)胞增殖及功能，可能是外泌體增強卵泡膜細(xì)胞活力的潛在機(jī)制［15］。

綜上所述，本研究證實了M1型巨噬細(xì)胞可以通過分泌外泌體引起卵泡膜細(xì)胞活力的改變，其潛在的機(jī)制可能是通過下調(diào)CDKN1B的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。這為進(jìn)一步探討PCOS疾病狀態(tài)下慢性炎癥狀態(tài)導(dǎo)致高雄激素血癥的作用機(jī)制提供新的思路，外泌體可能成為改善PCOS高雄激素血癥的潛在重要靶點。