鄭柳青,劉冬梅,張馨月,周欽育,黃燕燕,許喜林

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640)

近年來,隨著人們對健康越來越重視,乳酸菌的益生功能也受到了人們的廣泛關(guān)注。乳酸菌可以調(diào)節(jié)人體腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)平衡[1],降膽固醇[2],增強免疫力[3],提高機體內(nèi)營養(yǎng)因子的吸收和利用率[4]。鼠李糖乳桿菌大量應(yīng)用于發(fā)酵制品工業(yè),是目前研究最廣泛和深入的乳酸菌之一。鼠李糖乳桿菌在宿主患急性胃腸炎期間仍能促進腸道菌群的平衡,并能在宿主體內(nèi)定殖[5]。Kamal等[6]將鼠李糖乳桿菌添加到人工污染樣本的酸奶中,可減少致病菌數(shù)量甚至完全消除致病菌。

外源益生菌的生長環(huán)境與胃腸道環(huán)境相差很大,很多益生菌對胃腸道環(huán)境不耐受,因此許多學(xué)者認(rèn)為應(yīng)該從人體自身的胃腸道中篩選有潛在應(yīng)用價值的益生菌。Bin等[7]從人腸道中篩選出11株乳酸菌并進行菌株的益生性研究,這些菌株大多能較好的耐受胃腸道環(huán)境。Junjie等[8]的研究證明人源益生菌和人體腸道菌群之間有著特異選擇的關(guān)系。阿依米熱·毛拉木等[9]從新疆喀什地區(qū)的長壽老人腸道中分離篩選出具有較強的耐酸耐膽鹽能力的乳酸菌,為人源益生菌的開發(fā)利用提供了新的菌種來源。

目前市場上較為著名的益生菌株如BB12、LGG都來源于國外,國內(nèi)對本土益生菌株開發(fā)和利用尚不足。本實驗對從廣州一月齡嬰兒糞便中分離出的乳桿菌進行生理生化特征和生物學(xué)鑒定,并對LR-ZB1107-01進行了體外安全性評價,主要包括溶血性實驗、抗生素敏感性實驗以及動物急性毒性實驗。本實驗還對其代謝產(chǎn)物的抑菌性、人工胃腸液耐受性、腸道黏附性、疏水性以及自聚性進行了綜合評價并與鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469進行對比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LactobacillusrhamnosusZB1107-01 本課題組從嬰兒糞便中篩選獲得,于2019年4月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏編號為CGMCC NO. 5172;雌雄各半的健康成年SPF級KM小鼠20只 由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供;大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、單增李斯特菌CMCC(B)54002 由華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品安全實驗室保存;基礎(chǔ)MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱生物科技有限公司;葡萄糖、蔗糖、吲哚、過氧化氫 分析純,廣州化學(xué)試劑廠;哥倫比亞血瓊脂平板 廣州卯林試劑有限公司;Caco-2細胞、MEM細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基 豐暉生物科技有限公司。

SW-CJ-1FD型超凈工作臺 蘇州華科凈化設(shè)備有限公司;GI36TW型全自動高壓滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;LHS-80型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海百典儀器設(shè)備有限公司;TCS-SP2倒置顯微鏡 德國Leica公司;3543型CO2恒溫培養(yǎng)箱 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的鑒定

1.2.1.1 形態(tài)學(xué)分析 取分離純化后的單菌落涂片,進行革蘭氏染色,在顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)特征。

1.2.1.2 生理生化特征分析 參照伯杰氏細菌鑒定手冊(第 8 版)[10]進行。

1.2.1.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定 參照參考文獻提取DNA[11],取菌懸液1.0 mL,12000 r/min離心1 min,棄上清液,沉淀懸于0.6 mL溶菌酶溶液中,顛倒混勻后置于37 ℃下恒溫40 min。用試劑盒提取菌株的基因組DNA;利用模板DNA進行PCR擴增,擴增條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR擴增后用凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物特異性,切膠回收純化后PCR產(chǎn)物送廣州基迪奧生物技術(shù)有限公司進行測序,將測序結(jié)果與GenBank中相關(guān)菌株的基因組序列進行同源性對比,鑒定菌株。16S rDNA引物及序列如下:27F:AGA GTT TGA TCC TGG TCA;1492R:GGT TAC CTT GTT ACG ACT T。

1.2.2 菌株的安全性評價

1.2.2.1 菌株的溶血性檢測 將活化好的LR-ZB1107-01以及質(zhì)控菌株大腸桿菌用滅菌的接菌環(huán)劃線接種于哥倫比亞血瓊脂平板中,于37 ℃培養(yǎng)48 h,同時做空白試驗,觀察菌落周圍有無溶血圈出現(xiàn)。

1.2.2.2 抗生素敏感性實驗 參照張丹青[12]的實驗方法,將活化后的鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01菌液均勻涂布在MRS固體培養(yǎng)基表面,將浸泡有四環(huán)素(30 μg/片)、紅霉素(15 μg/片)、氨芐西林(30 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)的紙片置于已凝固的培養(yǎng)基上,每組抗生素紙片做3個重復(fù),37 ℃培養(yǎng)48 h。觀察并測量抗生素紙片周圍出現(xiàn)的透明圈。

1.2.2.3 動物經(jīng)口急性毒理試驗 選用18～22 g的健康成年SPF級KM小鼠20只,雌雄各半。將處于生長期的待測菌株用PBS緩沖液將濃度調(diào)整至1×108CFU/mL,空腹灌胃一次,每次灌胃容量為20.0 mL/kg體重。灌胃后立即觀察其活動表現(xiàn)、體重以及身體狀況變化,觀察期為14 d。

1.2.3 菌株的益生特性研究

1.2.3.1 抑菌活性 采用牛津杯法來測定LR-ZB1107-01代謝產(chǎn)物的抑菌性,金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特菌作為指示菌株,指示菌(約108CFU/mL)涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基表面,將無菌牛津杯平行放置于平板中,在牛津杯中加入200 μL 待測樣品,緩慢將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h,觀察并測量抑菌圈直徑大小。用上述相同的方法測定鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469的抑菌特性。

1.2.3.2 胃腸液耐受性 參考Strompfovád等[13]的方法,略有修改。活化后的LR-ZB1107-01菌液按照5%(v/v)的接種量,分別接種于pH=2、2.5、3、4的人工模擬胃液中,同時以無菌生理鹽水作為空白組,37 ℃培養(yǎng),在0、1、2、3 h取樣,計活菌數(shù)(CFU/mL)。菌液按照5%(v/v)的接種量接種于人工腸液中,同時以無菌生理鹽水為空白組,37 ℃培養(yǎng),在0、2、4、6、8 h取樣,計活菌數(shù)(CFU/mL)。鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469在上述相同條件下進行人工模擬胃液、腸液實驗。菌落計數(shù)方法參考GB 4789.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗 乳酸菌檢驗》。

1.2.3.3 腸道黏附性 Caco-2細胞傳代培養(yǎng)2～3次后,將細胞濃度調(diào)整至2×105個/每孔,傳代至24孔板中進行黏附實驗。調(diào)整LR-ZB1107-01濃度為1×107CFU/mL,PBS清洗2～3次24孔板,每孔加入1 mL菌液,37 ℃培養(yǎng)90 min進行黏附實驗。黏附完成后,PBS清洗未黏附的細胞,再加入1 mL無菌蒸餾水孵育60 min進行細胞裂解,將每孔中剩余的菌懸液吸出計數(shù),每組3個平行,計算鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01與Caco-2細胞的黏附情況,以平均每個細胞黏附的鼠李糖乳桿菌數(shù)來判斷其黏附強度,上述相同方法計算標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469與Caco-2細胞的黏附情況。

1.2.3.4 菌株疏水性和自聚力測定 根據(jù)Sabdshkumar等[14]的方法,略作修改。菌株過夜培養(yǎng),5000 r/min下離心10 min,收集菌體沉淀,無菌PBS緩沖液洗滌菌體兩次后,重懸于無菌PBS中,調(diào)節(jié)OD600=0.60±0.05(A0)。取2 mL菌懸液和2 mL二甲苯充分振蕩混勻,室溫靜置30 min。小心吸取水相,以無菌PBS為空白測定OD600值(A1)。表面疏水性(%)=(1-A1/A0)×100。自聚力測定參考Todorov等[15]的方法,稍加修改。菌懸液制備同疏水性實驗,取4 mL菌懸液,室溫下靜置24 h,小心吸取上層1 mL,測量OD600(A24)值。自聚力(%)=(1-A24/A0)×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)處理3次,實驗結(jié)果均表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(M±SD)。采用Excel 2016統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,數(shù)據(jù)間的分析方法采用單因素方差分析,顯著水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)學(xué)分析 分離得到的菌株革蘭氏染色后顯微照片如圖1,菌株在MRS固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)48 h后,菌落表面光滑有光澤,邊緣整齊,橢圓形或圓形。

圖1 LR-ZB1107-01革蘭氏染色鏡檢Fig.1 Gram staining micrograph of LR-ZB1107-01

2.1.2 生理生化特征分析 菌株的生理生化特征鑒定結(jié)果如表1所示,根據(jù)糖發(fā)酵及生理生化鑒定結(jié)果,參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版[10],可初步鑒定該菌株為鼠李糖乳桿菌。

表1 LR-ZB1107-01的生化特征及碳水化合物發(fā)酵實驗結(jié)果Table 1 Biochemistry features and results of carbohydrate tests of LR-ZB1107-01

2.1.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定 16S rDNA序列與GenBank中菌株進行同源性比較,結(jié)果表明該菌株與鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)ATCC53103同源性最高,達100%。于2019年4月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,簡稱CGMCC,保藏編號為CGMCC NO. 5172,將其命名為LR-ZB1107-01。該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2。

圖2 LR-ZB1107-01系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of LR-ZB1107-01

2.2 安全性評價結(jié)果

2.2.1 菌株的溶血活性檢測 溶血是指在溶血毒素及其他理化因素的作用下,紅細胞破裂,血紅蛋白逸出[16]。菌株代謝產(chǎn)物有無溶血活性被認(rèn)為是菌株安全性評價的重要指標(biāo)。如圖3所示,a為鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01,周圍無明顯溶血圈形成,屬于沒有毒性的γ-溶血,b為陽性對照大腸桿菌,屬于β-溶血組。

圖3 溶血活性檢測結(jié)果Fig.3 The results of hemolytic activity test

2.2.2 抗生素敏感性實驗結(jié)果 K-B紙片擴散實驗結(jié)果如表2,幾種常見的抗生素對鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01有較強的抑制作用,結(jié)果根據(jù)表3判斷。供試菌株對各種抗生素的抗性依據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)[17]制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)判斷。

表2 K-B紙片擴散實驗結(jié)果Table 2 K-B paper diffusion test results

表3 藥敏紙片含藥量及抗性判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Drug sensitive paper containing drug content and resistance to determine the standard

2.2.3 動物急性毒性試驗 在觀察期內(nèi)小鼠的活動、食欲正常,體重增加;試驗結(jié)束后,對存活動物解剖,肉眼未見心肝脾肺腎腸等內(nèi)臟器官異常。實驗菌株LR-ZB1107-01對小鼠不具有急性毒性作用。

2.3 菌株的益生性研究

2.3.1 抑菌活性 乳酸菌的代謝產(chǎn)物在一定程度上可以抑制致病菌的增長[18],本實驗選取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特菌作為指示菌株,抑菌結(jié)果如表4所示,兩株鼠李糖乳桿菌對三種指示菌株均有一定的抑制作用,抑菌圈直徑均超過2 cm,其中LR-ZB1107-01對大腸桿菌和單增李斯特菌的抑制作用稍強于標(biāo)準(zhǔn)菌株。周鮮嬌等[19]對分離自發(fā)酵酸菜中的鼠李糖乳桿菌進行抑菌活性測定,7株鼠李糖乳桿菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑在2～3 cm之間。

表4 鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469對四種指示菌的抑菌能力對比(cm)Table 4 The antibacterial ability of Lactobacillus rhamnosus ZB1107-01 and Lactobacillus rhamnosus ATCC7469(cm)

2.3.2 胃腸道耐受性 為在人體腸道內(nèi)定殖并發(fā)揮其益生性能,鼠李糖乳桿菌需具有耐受胃腸道環(huán)境的能力。如圖4(a)結(jié)果所示,LR-ZB1107-01在不同pH的人工胃液下存活狀態(tài)良好,活菌數(shù)變化與其空白組比較沒有顯著差異(P<0.05),在pH=2的胃液中暴露3 h后存活率仍高于99%。圖4(b)結(jié)果顯示鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在pH=2的胃液中暴露3 h后活菌數(shù)下降明顯,耐受性低于LR-ZB1107-01。王玉華等[20]從嬰兒糞便中篩選出的鼠李糖乳桿菌在pH=2的人工胃液環(huán)境中培養(yǎng)4 h后存活率約為57%。如圖5所示,LR-ZB1107-01和鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469均對人工腸液的耐受性較好,且LR-ZB1107-01在人工腸液中隨著時間的延長,活菌數(shù)略有增加。

圖4 鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01(a)和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469(b)對人工胃液耐受能力對比Fig.4 The survivability in artificial gastric ofLactobacillus rhamnosus ZB1107-01(a)and Lactobacillus rhamnosus ATCC7469(b)

圖5 鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01(a)和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469(b)對人工腸液耐受能力對比Fig.5 The survivability in artificial intestinal fluid ofLactobacillus rhamnosus ZB1107-01(a)and Lactobacillus rhamnosus ATCC7469(b)

2.3.3 腸道黏附性 黏附是鼠李糖乳桿菌與宿主腸道相互作用的第一步,是益生菌株在腸道內(nèi)發(fā)揮益生功能從而調(diào)節(jié)腸道菌群健康的一個必要條件。Caco-2細胞模型是一種人克隆結(jié)腸癌細胞,結(jié)構(gòu)和功能與分化后的小腸上皮細胞相似,可以模擬人腸道中的環(huán)境[21]。結(jié)果表明,LR-ZB1107-01可有效黏附于Caco-2細胞,平均黏附數(shù)為(13.3±3.2)個/細胞,標(biāo)準(zhǔn)菌株的黏附數(shù)為(12.8±2.4)個/細胞。薛銀剛[22]從我國傳統(tǒng)發(fā)酵制品中分離出的若干株乳酸菌對Caco-2細胞的黏附均值為10～19個/細胞。陳佩等[23]研究一株具有降糖作用的鼠李糖乳桿菌對Caco-2細胞的黏附值約為10個/細胞。

2.3.4 菌株的疏水性和自聚力檢測 細菌的疏水性和自聚性是益生菌對腸道非特異性黏附的重要指標(biāo)[24]。實驗結(jié)果如表5所示,LR-ZB1107-01的疏水性高于鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株,達48.6%。兩株菌的自聚力相差不大,均超過85%。熊世進等[25]測定人源鼠李糖乳桿菌MP-108的疏水性達90.10%,自聚力達51.54%,略高于LR-ZB1107-01。

表5 鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469的疏水性及自聚性能力對比Table 5 The ability of hydrophobicity and self-aggregation ofLR-ZB1107-01 and ATCC7469

從廣州1月齡健康的嬰兒糞便中分離出一株乳酸菌,經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征分析以及生物學(xué)鑒定,可確定該菌株為鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusZB1107-01)。對鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01進行了安全性評價,結(jié)果表明該菌株不溶血,對抗生素敏感,動物急性毒性實驗結(jié)果為無毒,該菌株安全。益生特性研究將LR-ZB1107-01與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469進行對比,LR-ZB1107-01可有效抑制三種致病菌,對大腸桿菌和單增李斯特菌的抑制效果略強于標(biāo)準(zhǔn)菌株。LR-ZB1107-01對胃腸道環(huán)境高度耐受,表現(xiàn)出對酸(pH2)的強耐受性。自聚性和對Caco-2細胞的黏附性與標(biāo)準(zhǔn)菌株相當(dāng),疏水性能遠高于標(biāo)準(zhǔn)菌株。本研究篩選出具有潛在利用價值的益生菌,豐富了我國的乳酸菌資源庫,為開發(fā)新的乳酸菌產(chǎn)品創(chuàng)造條件,也為該菌在益生菌發(fā)酵工業(yè)的進一步利用提供了理論基礎(chǔ)。