何曉梅，徐海軍，鄧 輝，張珍林，孫傳伯，谷仿麗，余茂耘

(皖西學院 生物與制藥工程學院 安徽省中藥資源保護與持續(xù)利用工程實驗室，安徽 六安 237012)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是蘭科(Orchidaceae)石斛屬(DendrobiumSw.)多年生草本植物，含有多糖、酚酸類、黃酮類、菲類、萜類、糖苷類、木脂類、聯(lián)芐類、生物堿、有機酸、氨基酸和礦質(zhì)元素等，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材[1]?，F(xiàn)階段鐵皮石斛功能研究主要集中在抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗炎及增強人體免疫力等方面，具有益胃生津、滋陰補益、清肺、明目、潤膚以及提高人體免疫力等功效[2]。

糖蛋白是一種結合蛋白質(zhì)，由分枝的寡糖與多肽共價構成的復合糖，廣泛分布于植物體中，具有抗腫瘤、增強機體免疫力、抗血小板聚集等[3]藥理作用。鐵皮石斛富含多種化合物，目前對多糖、酚類、石斛堿等含量及其功能研究較多[4]，而對其糖蛋白的研究未見報道。

本文中，筆者以霍山鐵皮石斛為研究對象，通過鹽溶(NaCl溶液)和鹽析(飽和硫酸銨溶液)得到粗提物，進行SDS-PAGE電泳，通過PAS染色和考馬斯亮藍R-250染色確定粗提物中含有糖蛋白，然后分別經(jīng)DEAE 52離子柱和Sephadex G-100凝膠柱進一步分離純化糖蛋白組分并測定其抗氧化活性，以期為石斛組成成分的深入研究以及生物活性物質(zhì)石斛糖蛋白在食品、生物和醫(yī)藥上的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

霍山鐵皮石斛楓斗由植物細胞工程安徽省工程技術研究中心提供；牛血清白蛋白(BR,98%)、葡萄糖標準品(≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；DPPH(HPLC≥97%，日本原裝進口)，上海展云化工有限公司。其他試劑均為市售分析純。

FA-1204N型電子天平，上海越平科學儀器有限公司；高速組織搗碎機，上海凈信實驗設備科技部；DHG-9101-1型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海瑯玕實驗設備有限公司；冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；HH-4C型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵、旋轉蒸發(fā)儀、GL-21M型高速冷凍離心機，湖南凱達科學儀器有限公司；WFZ UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；電泳儀，北京白晶生物技術有限公司；SHJ-A4型水浴磁力攪拌器，金壇市國旺實驗儀器廠；JY15A脫色搖床，北京君意東方電泳設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 霍山鐵皮石斛的預處理

取一定量的霍山鐵皮石斛楓斗，經(jīng)粉碎機粉碎，過0.425 mm篩，依次用石油醚和體積分數(shù)為80%乙醇回流至無色，風干后備用。

1.2.2 霍山鐵皮石斛糖蛋白的提取

準確稱取15.000 g石斛粉末3份，每份分別加入0.3 mol/L的NaCl溶液300 mL，于85 ℃恒溫水浴2 h，離心(5 000 r/min、15 min)，浸提3次，合并3次上清液濃縮到500 mL，Sevage法脫蛋白，3份分別用飽和度為30%、60%和90%硫酸銨[5]沉淀12 h，離心(5 000 r/min、15 min)，透析48 h(每隔6 h換水)，聚乙二醇10 000濃縮，真空冷凍干燥得CGPI、CGPII和CGPIII。

1.2.3 霍山鐵皮石斛糖蛋白的SDS-PAGE電泳檢測

參照文獻[6]，制備質(zhì)量分數(shù)分別為12%的分離膠和5%的濃縮膠，CGPI、CGPII和CGPIII溶液(20 mg/mL)上樣量為10 μL。

1.2.4 霍山鐵皮石斛糖蛋白的純化

1) DEAE Cellulose- 52 陰離子交換柱層析。將檢測現(xiàn)象最明顯的糖蛋白粗品CGPIII溶液(20 mg/mL)微孔濾膜過濾后上柱(1.6 cm×20 cm)，用0～1.0 mol/L NaCl溶液進行線性梯度洗脫，洗脫速度為1 mL/min，每管收集5 mL，在 490 nm 處采用苯酚-硫酸法檢測多糖流出，在280 nm 處采用Bradford法檢測蛋白質(zhì)流出，合并既有多糖檢出又有蛋白質(zhì)檢出管的溶液，使用攪拌式超濾儀濃縮，透析，冷凍干燥，4 ℃保存[7]。

2)Sephadex G-100柱層析。選用Sephadex G-100 凝膠柱(1.6 cm×80 cm)，上樣經(jīng)微孔濾膜過濾所得糖蛋白復合物溶液(10 mg/mL，5 mL)進行進一步分離純化，水洗脫，流速為1 mL/mim，自動部分收集器收集洗脫液，分別于490和280 nm檢測糖和蛋白的吸收，收集二者重合的峰，超濾濃縮，蒸餾水透析除鹽，冷凍干燥，4 ℃保存。

1.2.5 霍山鐵皮石斛糖蛋白含量的測定

1)糖含量測定。采用苯酚-硫酸測定法測定總糖[8]。以葡糖糖濃度ρ葡萄糖為橫坐標，吸光度A值為縱坐標，繪制標準曲線，得葡萄糖標準曲線方程：y=10.503ρ葡萄糖-0.015 4，R2=0.995 3。取石斛糖蛋白溶液1.0 mL測定樣品吸光度，計算鐵皮石斛中多糖的質(zhì)量濃度。鐵皮石斛中多糖的得率計算見式(1)。

X糖=10-3nρ葡萄糖V/m

(1)

式中：X糖為糖得率，%；ρ葡萄糖為吸光度值代入標曲計算的糖蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL；n為稀釋倍數(shù)；V為樣品體積，mL；m為石斛干品質(zhì)量。

2)蛋白質(zhì)含量測定。采用考馬斯亮藍G250測定法[9]。以牛血清白蛋白濃度ρ蛋白為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，蛋白質(zhì)標準曲線為：y=5.794 5ρ蛋白+0.048 3，R2=0.992 3。取石斛糖蛋白溶液1.0 mL測定樣品吸光度，計算鐵皮石斛中蛋白的質(zhì)量濃度。鐵皮石斛中蛋白得率的計算見式(2)。

X蛋白=10-3ρ蛋白V/m

(2)

式中：X蛋白為石斛中蛋白的得率，%；ρ蛋白為吸光度值代入標曲計算的石斛中蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.6 石斛糖蛋白抗氧化活性的研究

1) 自由基·DPPH的清除。在試管中依次加入95%乙醇配制的10 mmol/mL的DPPH溶液2.0 mL和不同質(zhì)量濃度的糖蛋白溶液2.0 mL，混合后避光靜置30 min，以2.0 mL蒸餾水加上2.0 mL 95%乙醇調(diào)零，于517 nm處測定吸光度A1。取DPPH溶液2.0 mL和蒸餾水2.0 mL混合后測吸光度A2。取不同質(zhì)量濃度的糖蛋白溶液2.0 mL分別加入95%乙醇2.0 mL，混合后靜置30 min測吸光度A3[10]。自由基·DPPH的清除率計算見式(3)。

·DPPH清除率=[1-(A1-A3)/A2]×100%

(3)

2)·OH的清除。采用鄰二氮菲比色法[11]測定樣品的抗氧化活性，在536 nm處測吸光度。取3支試管，依次加入1.0 mL鄰二氮菲溶液(7.5 mmol/L)、2.0 mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)、1.0 mL硫酸亞鐵溶液(9 mmol/L)，混勻，然后3只試管分別加入1.0 mL 0.01% H2O2、1.0 mL蒸餾水、1.0 mL不同濃度石斛糖蛋白溶液，于37 ℃水浴保溫1 h，以2.0 mL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)加4.0 mL蒸餾水做對照組，測定A損傷、A未損傷和A樣。·OH清除率的計算見式(4)。

·OH清除率=(A樣-A損傷)/(A未損傷-A損傷)×100%

(4)

(5)

4) 還原能力測定。在15 mL的離心管中依次加入2.5 mL磷酸緩沖液(pH 6.6)、1%鐵氰化鉀2.5 mL、不同濃度石斛糖蛋白溶液1.0 mL于50 ℃水浴保溫20 min，迅速冷卻后加入10%三氯乙酸2.5 mL，離心10 min。取上清液5.0 mL，再添加4.0 mL蒸餾水和0.1% FeCl31.0 mL，混勻后在700 nm處測吸光度A700[13]，以蒸餾水代替樣品作為調(diào)零組。Vc作陽性對照。

2 結果與分析

2.1 硫酸銨分級沉淀結果

分別應用飽和度為30%、60%和90%的硫酸銨對脫蛋白后的霍山鐵皮石斛氯化鈉提取液進行沉淀，得到糖蛋白粗品CGPI、CGPII和CGPIII這3個組分，結果見表1。

由表1可知，隨著硫酸銨飽和度的增加，糖得率和蛋白得率隨著增加，結果表現(xiàn)為糖蛋白得率增加，且每一組分中糖得率遠遠高于蛋白得率。

表1 霍山鐵皮石斛糖蛋白的硫酸銨分級沉淀

2.2 糖蛋白電泳

以SDS-PAGE電泳分析分離的石斛粗糖蛋白，結果如圖1所示。由圖1可知,無論是PAS染色還是考馬斯亮藍R250染色，CGPI、CGPII和CGPIII溶液都含有糖蛋白[14](糖蛋白的典型特征，PAS染色呈現(xiàn)出紅色，糖染色條帶和蛋白染色條帶水平位置一致)，分子量都在6.62×104附近，且主蛋白條帶明顯，雜蛋白條帶不明顯，糖條帶顯示濃度依次增強。此結果表明，所用的分離方法適合霍山鐵皮石斛糖蛋白的提取，而且隨著硫酸銨飽和度的增大，糖蛋白鹽析效果越明顯。因此，后續(xù)實驗以糖蛋白濃度最高的CGPIII作為材料進一步研究。

M為標準蛋白；1～3泳道分別為90%、60%、30%硫酸銨分級沉淀的糖蛋白考馬斯亮藍染色條帶；4～6泳道分別為30%、60%、90%硫酸銨分級沉淀的糖蛋白PAS染色條帶圖1 霍山石斛粗糖蛋白SDS-PAGE 電泳圖Fig.1 SDS-PAGE result of Huoshan D.officinale crude glycoprotein

2.3 糖蛋白的分離純化

利用DEAE 52 離子交換柱層析來純化分離霍山鐵皮石斛粗糖蛋白CGPIII，結果如圖2所示。由圖2可知,CGPIII溶液在490和280 nm均有較強的吸收，且吸收峰相互對應吻合，表明該溶液含有糖和蛋白，具有糖蛋白洗脫峰的典型特征[15]。收集該洗脫峰的溶液，透析，濃縮，干燥，得到糖蛋白復合物GP。

圖2 DEAE 52 柱層析分離純化霍山鐵皮石斛粗糖蛋白Fig.2 DEAE Cellulose 52 anion exchange chromatography of crude glycoprotein fractions from HuoshanD.officinale

將上述糖蛋白復合物GP通過Sephadex G-100凝膠柱(分離范圍為(0.4～15)×104)進一步分離純化，結果如圖3所示。由圖3可以看出，GP經(jīng)Sephadex G-100柱層析分離后得到2個組分GP1和GP2，2個組分分別在490和280 nm處具有相對應吻合的吸收峰，表明組分GP1和GP2中都含有糖和蛋白，且通過Sephadex G-100分子篩作用將2組分分離開。收集組分GP1和GP2，透析，濃縮，干燥，備用。

圖3 Sephadex G-100柱層析分離純化霍山鐵皮石斛糖蛋白Fig.3 Sephadex G-100 gel chromatography of glycoprotein from Huoshan D.officinale

2.4 GP1和GP2中糖與蛋白的含量

根據(jù)所開發(fā)的純化方法測得組分GP1和GP2中都含有糖和蛋白，且糖含量高于蛋白含量，如表2所示。

由表2可知，GP1和GP2中糖蛋白含量分別約為95%和87%，前者純度高于后者，同時都含有一定比例的未知物質(zhì)，有待進一步分析研究。

表2 GP1和GP2中糖與蛋白的含量

注：w(糖)=m(糖)/m(糖蛋白)×100%;w(蛋白)=m(蛋白質(zhì))/m(糖蛋白)×100%。

2.5 抗氧化活性的研究結果

圖4 糖蛋白對·DPPH的清除能力Fig.4 Scavenging ability of glycoprotein to ·DPPH

圖5 糖蛋白對的清除能力Fig.5 Scavenging ability of glycoproteins to

圖6 糖蛋白對·OH的清除能力Fig.6 Scavenging ability of glycoproteins to ·OH

組分IC50/(mg·mL-1)·DPPH·O-2·OHGP11.21.8<0.5GP21.82.32.0

2.5.3 還原能力

抗氧化劑通過自身的還原作用供出電子而清除自由基，還原能力越大，抗氧化性越強。因此樣品的還原能力與抗氧化活性之間有顯著的相關性。

圖7 糖蛋白還原能力的測定Fig.7 Determination of the reductive ability of glycoprotein

考察霍山鐵皮石斛糖蛋白的還原能力，結果見圖7。由圖7可以看出，隨著石斛糖蛋白質(zhì)量濃度的增大，其還原能力就越大，且GP1比GP2的還原能力強；當糖蛋白的質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，鐵皮石斛糖蛋白GP1的還原力為相同濃度Vc的64.5%，GP2的還原力為相同濃度的Vc還原力的50.4%，表明鐵皮石斛糖蛋白具有較強的抗氧化活性。在實驗中研究的濃度范圍內(nèi)，糖蛋白還原力遠遠低于Vc的還原力。

3 結論

通過SDS-PAGE電泳、PAS染色和考馬斯亮藍R-250染色表明采用鹽溶和鹽析的方法可以提取霍山鐵皮石斛糖蛋白，且分子量在6.62×104左右。

采用DEAE Cellulose 52 離子交換柱層析初步分離純化霍山鐵皮石斛粗糖蛋白，得到1條明顯的吸收峰；Sephadex G-100凝膠柱柱層析進一步分離純化得到2個不同的吸收峰，即2個不同的糖蛋白組分GP1和GP2。