徐 彤，鄭旭東，崔羽歆，王 俊，朱慧玲，付建紅，姚雪丹

(新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 新疆特殊環(huán)境物種多樣性應(yīng)用與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054)

昆蟲在其一生中要經(jīng)歷幾次蛻皮，初生的新表皮柔軟色淡，經(jīng)過硬化和黑化過程變堅(jiān)硬。多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PO)是這一黑化硬化過程中的關(guān)鍵性酶，它能夠催化單酚羥化為二酚(如L-DOPA)，并把二酚氧化成醌，醌在非酶促條件下最終生成黑色素[1]。多酚氧化酶不僅參與黑色素形成、角質(zhì)硬化和傷口愈合，還作為非自身識(shí)別系統(tǒng)在對(duì)寄生物的防御反應(yīng)中發(fā)揮作用。由于不同昆蟲體內(nèi)的多酚氧化酶表現(xiàn)不同的酶學(xué)特性，因此深入研究不同來源多酚氧化酶的生物學(xué)特性，對(duì)開發(fā)新型“環(huán)境友好”殺蟲劑具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義[1]。

春尺蠖(ApochemiacinerariusErsch)又稱楊尺蠖，屬鱗翅目尺蛾科，該害蟲食性雜、適應(yīng)性強(qiáng)，除危害果樹外，對(duì)新疆塔里木河中下游瀕危植物胡楊亦構(gòu)成較為嚴(yán)重的危害[2]。采用化學(xué)方法防治，存在害蟲抗藥性增強(qiáng)及環(huán)境污染等問題[3]。篩選對(duì)PO具有強(qiáng)力抑制作用的化合物是開發(fā)以PO為靶標(biāo)的新型農(nóng)藥的有效途徑。許多化合物對(duì)昆蟲PO具有較好的抑制作用，如槲皮素、曲酸、苯甲醛類、苯甲酸類及苯甲醛縮氨基硫脲類等化合物及其類似物[4-10]，而鱗翅目尺蛾科害蟲的PO抑制劑的研究?jī)H有零星報(bào)道，張永亮等[1]研究了槲皮素、硫脲對(duì)桑尺蠖PO具有抑制作用，劉春英等[11-12]研究了槐尺蠖PO和棗尺蠖PO的酶學(xué)性質(zhì)并發(fā)現(xiàn)槲皮苷和硫脲對(duì)酶活性有抑制作用。

尖果沙棗(ElaeagnusoxycarpaSchlechtend)屬胡頹子科(Elaeagnaceae)胡頹子屬(Elaeagnus)，其花、果、枝、葉和樹皮都可入藥，能治療慢性支氣管炎、閉合性骨折、消化不良、神經(jīng)衰弱等病癥[13]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)沙棗花、果的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，而對(duì)沙棗葉的化學(xué)成分及其生物活性的研究報(bào)道較少。夏米斯巴奴·艾則孜等[14]通過化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)初步判定新疆沙棗葉中含有多肽、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、酚類、鞣質(zhì)、皂苷、黃酮、甾體和三萜類等成分。王培香等[15]通過DPPH法測(cè)定了沙棗葉醇提取物各組分的抗氧化活性。Pumnuan等[16]研究發(fā)現(xiàn)沙棗葉醇提取物對(duì)小菜蛾幼蟲的殺蟲特性，但殺蟲機(jī)制尚不明確。

本文中，筆者采用中壓色譜和C18反相制備型色譜技術(shù)從新疆尖果沙棗葉中分離得到6個(gè)化合物，并測(cè)定了其中2個(gè)化合物對(duì)春尺蠖多酚氧化酶的抑制作用，旨在發(fā)現(xiàn)新型酚氧化酶抑制劑，為綜合開發(fā)利用新疆沙棗樹植物資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

春尺蠖5齡幼蟲采自新疆烏魯木齊近郊某農(nóng)場(chǎng)農(nóng)田防護(hù)林榆樹上，將其置于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。尖果沙棗葉采于新疆吐魯番地區(qū)。植物葉洗凈、陰涼處晾干后粉碎備用。

1.2 方法

1.2.1 多酚氧化酶的制備

參照文獻(xiàn)[11]的方法并略有改進(jìn)。取冰凍保存的春尺蠖幼蟲按1 g∶ 10 mL的比例加入預(yù)冷的pH 6.5、0.02 mol/L磷酸緩沖液(PBS)冰浴勻漿，4 ℃下抽提30 min，6 000 r/min離心30 min。向上清液中加入40%飽和度的硫酸銨，4 ℃靜置30 min后，6 000 r/min離心30 min。收集沉淀，用適量PBS使其充分溶解，并在相同的緩沖液中透析24 h，其間更換3～4次緩沖液，濃縮后經(jīng)Sephadex G-100凝膠過濾，即得到待測(cè)的春尺蠖多酚氧化酶酶液。

1.2.2 多酚氧化酶的活力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17]的方法并略有改進(jìn)。向1.5 mL 14 mmoL/L鄰苯二酚溶液中加入1.4 mL 0.02 mol/L pH 6.5的PBS，30 ℃水浴中溫育30 min后，加入0.1 mL酶液混勻，于410 nm下測(cè)定吸光度A410隨時(shí)間變化的曲線，從直線的斜率可求得該酶活力，以每分鐘每毫克蛋白吸光度改變0.001定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.3 酶的最適pH測(cè)定

設(shè)定酶反應(yīng)體系緩沖液的pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0和10.0。其中，pH 3.0、4.0和5.0用0.01 mol/L HAc-NaAc緩沖液，pH 9.0和10.0用0.01 mol/LGly-NaOH緩沖液，其余用0.01 mol/L PBS。以鄰苯二酚為底物，測(cè)定pH對(duì)酶活力的影響。

1.2.4 酶的最適溫度測(cè)定

將酶反應(yīng)體系分別置于不同溫度(10、15、20、25、30、35和40 ℃)水浴中保溫30 min。然后加入酶液，立即測(cè)定殘留酶活力。以A410最高時(shí)的酶活力作為100%，以相對(duì)酶活力與溫度作圖。

1.2.5 酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定

將酶液分別置于30、35、40、45、50、55、60和70 ℃的恒溫水浴中保溫15 min，每5 min取出一次酶液，測(cè)定酶的殘留酶活力。

1.2.6 底物專一性及米氏常數(shù)(Km)測(cè)定

以不同濃度的鄰苯二酚(3.33～20 mmol/L)、L-多巴(0.4～2 mmol/L)和焦性沒食子酸(0.43～5 mol/L)為底物，按照酶活力測(cè)定方法分別在各自最適波長(zhǎng)下測(cè)定酚氧化酶對(duì)不同底物的米氏常數(shù)(Km)，比較底物專一性。

1.2.7 沙棗葉化學(xué)成分的提取與分離

粉碎的尖果沙棗葉中加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液浸提，超聲提取后抽濾，離心后上清液減壓蒸餾。得到的乙醇提取物中加入等體積的乙酸乙酯，分3次萃取得到的乙酸乙酯相萃取液減壓蒸餾濃縮，用含2%二甲基亞砜的pH 6.8、0.1 mol/L PBS溶解得到的沙棗葉醇提取物。采用甲醇水梯度洗脫的方式先進(jìn)行劃段，共收集到61個(gè)組分，根據(jù)色譜分析結(jié)果將61個(gè)組分中主要成分相同的進(jìn)行合并得到25個(gè)組分(Fr)。根據(jù)體外酶活性測(cè)定結(jié)果合并重復(fù)的化學(xué)成分，有11個(gè)組分具有較明顯的主峰，進(jìn)一步采用C18反相硅膠柱精制分離得到單體化合物。采用核磁共振、質(zhì)譜等方法對(duì)分離的化合物進(jìn)行表征。

1.2.8 沙棗葉單體化合物對(duì)多酚氧化酶活力的影響

在以鄰苯二酚為底物的測(cè)活體系中，加入不同濃度的單體化合物，以不加化合物為對(duì)照，測(cè)定酶相對(duì)的剩余活力，比較導(dǎo)致酶活力下降50%的抑制劑濃度(IC50值)，根據(jù)IC50值闡明其抑制強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 多酚氧化酶的制備

為了研究不同飽和度的硫酸銨溶液制備多酚氧化酶的效果，對(duì)多酚氧化酶粗提液進(jìn)行分級(jí)鹽析，取各飽和度下的上清液和沉淀分別測(cè)定并比較酶活力，結(jié)果見表1。由表1可知：用40%飽和度硫酸銨處理過后的沉淀中酶相對(duì)活力最高，此時(shí)酶比酶活提高2.66倍，回收率為68.6%，表明用飽和硫酸銨溶液對(duì)春尺蠖酚氧化酶進(jìn)行純化可取得較好效果。然而，經(jīng)Sephadex G-100柱層析純化后，活力回收率較低，僅為9.01%，純化倍數(shù)為6.06倍。此結(jié)果表明用Sephadex G-100進(jìn)行柱層析對(duì)該酶的純化效果不太理想。

表1 春尺蠖多酚氧化酶的部分純化

2.2 多酚氧化酶的酶學(xué)特性

2.2.1 pH對(duì)酶活力的影響

在pH為5.0～7.5的范圍內(nèi)測(cè)定不同pH對(duì)春尺蠖多酚氧化酶活性的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知：當(dāng)磷酸緩沖液的pH為6.5時(shí)，PO酶活力達(dá)到最大值，pH為6.0和7.0時(shí)，活性分別為最大值的65.4%和55.9%；當(dāng)緩沖液pH為5.0時(shí)，活性下降約55%，當(dāng)pH為7.5時(shí)，活性降至最大活性的32.1%。

圖1 pH對(duì)春尺蠖多酚氧化酶活力的影響Fig.1 Effect of pH on polyphenol oxidase activity from Apochemia cinerarius Ersch

圖2 溫度對(duì)春尺蠖多酚氧化酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on polyphenol oxidase activity from Apochemia cinerarius Ersch

圖3 溫度對(duì)春尺蠖多酚氧化酶穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of temperature on polyphenol oxidase stability from Apochemia cinerarius Ersch

2.2.2 溫度對(duì)酚氧化酶活力的影響

春尺蠖多酚氧化酶活力與溫度的關(guān)系如圖2～圖3所示。

由圖2可知：當(dāng)溫度在 10～25 ℃之間時(shí)，酶活力隨著溫度的升高而增加；溫度高于25 ℃時(shí)，酶活力則隨著溫度的升高而下降。因此，以鄰苯二酚為底物，酚氧化酶的最適溫度為25 ℃。

由圖3可知，在每個(gè)設(shè)定的實(shí)驗(yàn)溫度下，隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力均呈下降趨勢(shì)。如在45 ℃下保溫5 min后，酶活力僅為原活力的50.8%；特別當(dāng)溫度升至50 ℃以上時(shí)，隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力下降較為迅速；至60 ℃時(shí)保溫15 min，酶趨于失活。由此可知，春尺蠖多酚氧化酶是一種熱穩(wěn)定性較低的酶。酶對(duì)溫度的敏感性，首先與酶分子本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)，其次與一系列條件(如酶的純度、濃度、有無底物和保護(hù)劑存在、介質(zhì)的pH離子強(qiáng)度等)有關(guān)。

2.2.3 多酚氧化酶底物專一性及米氏常數(shù)(Km)測(cè)定

在最適pH和最適溫度條件下，分別改變底物鄰苯二酚、L-多巴或焦性沒食子酸的濃度，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，求得春尺蠖酚氧化酶催化鄰苯二酚、L-多巴和焦性沒食子酸的Km值分別為1.11、1.3和6.45 mmol/L。由此可知，春尺蠖酚氧化酶與底物L(fēng)-多巴的親和力略小于與底物鄰苯二酚的親和力，兩者均大于該酶對(duì)底物焦性沒食子酸的親和力。

2.3 沙棗葉化學(xué)成分的分離

對(duì)尖果沙棗葉用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇提取，并對(duì)提取物的化學(xué)成分進(jìn)行初步研究，用常壓色譜、中壓制備色譜和C18反相制備型色譜等方法進(jìn)行分離純化，從中分離6個(gè)化合物，目前已鑒定了2個(gè)化合物，其余單體化合物正在進(jìn)行鑒定?；衔?的結(jié)構(gòu)經(jīng)與文獻(xiàn)[18]比較，與L-色氨酸相似，故鑒定為L(zhǎng)-色氨酸，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式及圖譜如圖4所示。化合物7的結(jié)構(gòu)經(jīng)Scifinder檢索為首次從該植物中分離得到的一種新化合物，命名為“沙棗葉苷”，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式及圖譜如圖5所示。

圖4 化合物6的結(jié)構(gòu)式、1H NMR和13C NMR譜圖Fig.4 Structural formula,1H NMR and 13C NMR spectra of compound 6

圖5 化合物7的結(jié)構(gòu)式、1H NMR和13C NMR譜圖Fig.5 Structural formula,1H NMR and 13C NMR spectra of compound 7

2.4 沙棗葉單體化合物對(duì)多酚氧化酶活力的影響

分別以化合物6和化合物7為效應(yīng)物，研究它們對(duì)春尺蠖多酚氧化酶催化鄰苯二酚氧化反應(yīng)活力的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知：這2種單體化合物對(duì)多酚氧化酶活力均有較大的影響，酶的剩余活力與效應(yīng)物的濃度呈依賴關(guān)系，隨著抑制劑濃度的增大，酶活力逐漸下降。兩種化合物的質(zhì)量濃度低于0.125 mg/mL時(shí)，多酚氧化酶的活力下降較快；隨著濃度的增大，酶活力下降趨于平緩。經(jīng)0.125 mg/mL的化合物6作用后，多酚氧化酶的剩余酶活力為46.9%，經(jīng)0.125 mg/mL化合物7作用后，酶的剩余酶活力為50.9%。由圖6可知，2種化合物對(duì)春尺蠖多酚氧化酶活力的IC50值約為0.125 mg/mL。

圖6 沙棗葉中分離的兩個(gè)化合物對(duì)春尺蠖多酚 氧化酶活力的影響Fig.6 Effects of two compounds isolated from leaves of Elaeagnus oxycarpa Schlechtend on phenoloxidase activity

3 結(jié)論

采用40%飽和度的硫酸銨沉淀和Sephadex G-100凝膠過濾層析等步驟對(duì)新疆烏魯木齊春尺蠖多酚氧化酶進(jìn)行純化，使比酶活提高了6.06倍，但回收率較低，表明烏魯木齊春尺蠖酚氧化酶的熱穩(wěn)定性較差。烏魯木齊春尺蠖多酚氧化酶的最適pH為6.5，最適溫度為25 ℃時(shí)活性最高，這與一些尺蛾科害蟲的多酚氧化酶的性質(zhì)不同，如槐尺蠖、棗尺蠖、桑尺蠖的多酚氧化酶最適pH均為7.0，最適溫度為37 ℃，產(chǎn)生差異的原因可能與酶的來源以及測(cè)定的條件不同有關(guān)。當(dāng)溫度在45 ℃以上時(shí)，烏魯木齊春尺蠖多酚氧化酶隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力下降較為明顯，在50 ℃時(shí)保溫15 min，酶活力下降為原活力的27.3%，在60 ℃時(shí)保溫15 min，酶趨于失活。

選擇3種多元酚作為底物研究春尺蠖多酚氧化酶的底物專一性，結(jié)果表明烏魯木齊春尺蠖多酚氧化酶對(duì)鄰苯二酚的親和力最高，對(duì)焦性沒食子酸的親和力最低。

明確了沙棗葉中分離的2個(gè)單體化合物對(duì)春尺蠖多酚氧化酶具有較好的抑制活性，此結(jié)果將會(huì)進(jìn)一步指導(dǎo)該類化合物的定量結(jié)構(gòu)活性(QSAR)相關(guān)技術(shù)研究，以期用于指導(dǎo)開發(fā)“昆蟲生命活動(dòng)干擾劑”。