成 榮, 王 蕭, 程 璐, 張 唯, 丁黎明, 高利增, 2, 許卓斌, 2

( 揚(yáng)州大學(xué), 1. 醫(yī)學(xué)院; 2. 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院; 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

納米酶是一類新型的似天然酶催化活性的納米材料, 能夠模擬生理?xiàng)l件下的催化行為[1]。對比天然酶，納米酶具有突出的催化活性、優(yōu)異的穩(wěn)定性以及低廉的制備成本等優(yōu)點(diǎn)[2-3], 可廣泛應(yīng)用于腫瘤診療、抗菌抗病毒、抗氧化與抗衰老以及檢測診斷等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[4-8]。目前，根據(jù)納米酶的化學(xué)成分進(jìn)行分類，主要包括金屬氧化物材料、貴金屬納米材料和非金屬納米材料[9-10]。四氧化三鐵納米酶(IONzymes)是目前應(yīng)用較為廣泛的納米酶，于2007年被發(fā)現(xiàn)具有過氧化物酶催化活性，在顏色底物存在下，其能夠催化過氧化氫(H2O2)產(chǎn)生顏色反應(yīng)[11], 此后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其具有過氧化氫酶催化活性、氧化物酶催化活性和超氧化物歧化酶催化活性。

近年來，有關(guān)IONzymes的修飾與改造的相關(guān)研究[12-13]越來越多，出現(xiàn)了大量催化活性更高、催化底物種類更多的新型納米酶，進(jìn)一步豐富了IONzymes在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。維生素是維持生命的必需物質(zhì)，與機(jī)體代謝密切相關(guān)。維生素B6參與機(jī)體抗氧化、抗炎反應(yīng)，能夠提高血清中谷胱甘肽(GSH)過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性，維持機(jī)體正常的生長、代謝、發(fā)育過程。本研究通過溶劑熱法合成了維生素B6修飾的四氧化三鐵納米酶(VB6-IONzymes)，并通過不同理化手段對其進(jìn)行表征，期望獲得催化活性更高、更為穩(wěn)定有效的納米酶，并探索通過發(fā)揮高效過氧化物酶活性在抗口腔變異鏈球菌(S.mutans)以及齲齒防治方面的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

六水合三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、乙二醇、3, 3′, 5, 5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和醋酸鈉均購自Sigma有限公司(美國)，維生素B6和二甲基亞砜(DMSO)均購自生物工程股份有限公司(上海)，過氧化氫購自阿拉丁試劑有限公司，蛋白胨、瓊脂粉和酵母提取物均購自Thermo Fisher 有限公司，磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀均購自中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，葡萄糖和蔗糖購自上海國藥集團(tuán)，苯甲基磺酰氟(PMSF)購自索萊寶科技有限公司(北京)。

1.2 VB6-IONzymes的制備

材料由溶劑熱法合成制備得到。稱取1.35 g FeCl3·6H2O并加入到40 mL乙二醇中，磁力攪拌使FeCl3· 6H2O溶解，得到澄清液體。在快速攪拌下緩慢加入3.60 g無水醋酸鈉，得到均勻混懸液。加入2.00 mmol維生素B6繼續(xù)攪拌，超聲10 min, 使維生素B6與上述溶液充分混勻。將攪拌得到的液體轉(zhuǎn)移至50.00 mL聚四氟乙烯反應(yīng)釜中, 200 ℃烘箱加熱12 h。反應(yīng)完全后將反應(yīng)釜取出，自然冷卻至室溫，用乙醇和水交替洗滌產(chǎn)物3次，得到黑色沉淀物。最后，將黑色沉淀物放入60 ℃烘箱烘干即可。

1.3 VB6-IONzymes的電鏡表征

利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)與透射電子顯微鏡(TEM)對本材料的體積和形貌進(jìn)行觀察。稱取適量VB6-IONzymes粉末配置成乙醇溶液，于TEM下觀察。將乙醇溶液少量多次地滴加在光滑硅片表面，烘箱烘干液體，硅片表面噴金，于SEM下觀察。

1.4 VB6-IONzymes的酶活測定與電子順磁共振波譜(ESR)測試

利用多功能酶標(biāo)儀對VB6-IONzymes的過氧化物酶活性進(jìn)行檢測。反應(yīng)總體系200.00 μL, 在96孔板中進(jìn)行。在0.10 mol/L、pH值為4.50的醋酸鈉緩沖體系下，每孔加入樣品溶液(終濃度10.00 μg/mL)、一定濃度的TMB和H2O2。當(dāng)以H2O2為變量時(shí)，加濃度梯度為0、18.63、37.13、74.25、148.50、297.00、594.00和1 188.00 mmol/L的H2O2, 此時(shí)TMB終濃度為833.00 μmol/L。37 ℃條件下，用酶標(biāo)儀掃描652.00 nm下每孔吸光度，掃描時(shí)間持續(xù)300 s, 使用GraphPad Prism軟件分析數(shù)據(jù)獲得米氏方程并比較催化效率。

采用電子順磁共振波譜儀對實(shí)驗(yàn)中羥基自由基的產(chǎn)生情況進(jìn)行檢測。反應(yīng)總體系100.00 μL, 加入5.00 μL VB6-IONzymes溶液(2.00 mg/mL)、20.00 μL自由基捕獲劑BMPO(0.01 mol/L)、65.00 μL醋酸鈉(pH值為4.55)和10.00 μL H2O2(3.33 mol/L), 對照組不加VB6-IONzymes溶液，振蕩混勻，取樣，電子順磁共振波譜儀檢測樣品中羥基自由基特征峰。

1.5 VB6-IONzymes抗變異鏈球菌測試

將變異鏈球菌UA159接種于經(jīng)過濾的含2.50%蛋白胨、1.50%酵母提取物和1.00%葡萄糖的超濾胰蛋白胨酵母抽提液(UFTYE)的液體培養(yǎng)基上, 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。次日，按比例轉(zhuǎn)接細(xì)菌并培養(yǎng)至600.00 nm波長處吸光值(OD600)達(dá)到1.00。1.50 mL離心管中加入800.00 μL PBS緩沖液(pH值為7.40)和100.00 μL菌液，再分別加入100.00 μL PBS緩沖液、100.00 μL IONzymes(終濃度0.50 mg/mL)或VB6-IONzymes(終濃度0.50 mg/mL), 混勻并作用30 min。以10倍梯度稀釋混合液，并取100.00 μL適宜梯度的稀釋液在含2.50%蛋白胨、1.50%酵母提取物、1.75%瓊脂和1.00%葡萄糖的UFTYE固體培養(yǎng)基表面均勻涂布。將瓊脂板倒置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約36 h后取出計(jì)數(shù)。

1.6 VB6-IONzymes抗變異鏈球菌生物膜測試

將變異鏈球菌UA159接種于UFTYE液體培養(yǎng)基, 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，次日轉(zhuǎn)接細(xì)菌并培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600=1.00)。早晨空腹取唾液與1.00 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)混勻, 4 ℃下6 500轉(zhuǎn)/min離心10 min, 取上清液過濾除菌備用。將高壓滅菌后的生物膜培養(yǎng)裝置放入無菌24孔板，每孔加入2.80 mL無菌唾液, 37 ℃培養(yǎng)箱中靜置1 h。將與唾液孵育過的羥基磷灰石圓片(sHA)用無菌水蘸洗3次，然后分別與VB6-IONzymes溶液(終濃度0.50 mg/mL)、H2O2(終濃度1.00%)和VB6-IONzymes溶液+H2O2(VB6-IONzymes終濃度0.50 mg/mL, H2O2終濃度1.00%)充分接觸30 min。

另取一無菌24孔板，每孔加入2.80 mL含1.00%蔗糖的UFTYE液體培養(yǎng)基(其中含濃度為105CFU/mL的變異鏈球菌)，將經(jīng)過處理的羥基磷灰石圓片放入，實(shí)驗(yàn)時(shí)始終保持圓片與孔板垂直。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)總時(shí)長43 h。在19、29 h時(shí)需更換新鮮無菌UFTYE液體培養(yǎng)基，并將圓片與上述各組溶液再次充分接觸30 min后用清水洗滌3次。將羥基磷灰石表面培養(yǎng)至43 h的變異鏈球菌生物膜用刮刀小心刮下，超聲使其完全均勻破碎，取100.00 μL液體梯度稀釋，在UFTYE固體培養(yǎng)基表面均勻涂布，倒置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)約36 h后取出計(jì)數(shù)。最后將剩余的生物膜懸液轉(zhuǎn)移至烘箱中, 60 ℃烘干，稱重即得干重。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 Excel與GraphPad Prism 5數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)輸入、整理及統(tǒng)計(jì)，采用t檢驗(yàn)比較不同組數(shù)據(jù)的差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 VB6-IONzymes的制備與表征

通過溶劑熱法，本研究首先合成了IONzymes。掃描電鏡顯示，未修飾的IONzymes呈現(xiàn)出規(guī)則的球形(圖1B), 粒徑約為200.00 nm, 體積均一。通過在合成過程中加入2.00 mmol的維生素B6(圖1A)對其進(jìn)行修飾，獲得VB6-IONzymes。掃描電鏡結(jié)果顯示，納米酶形貌發(fā)生顯著變化，呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，粒徑減小至100.00 nm以下(圖1C)。透射電鏡結(jié)果也顯示, VB6-IONzymes失去球體形態(tài)而變得不規(guī)則(圖1D)。

A: 維生素B6結(jié)構(gòu); B: IONzymes掃描電鏡表征; C: VB6-IONzymes掃描電鏡表征;D: VB6-IONzymes透射電鏡表征。

圖1 維生素B6結(jié)構(gòu)及其修飾IONzymes前后電鏡表征

2.2 VB6-IONzymes酶活性顯著增強(qiáng)

通過檢測IONzymes在維生素B6修飾前后的過氧化物酶活性發(fā)現(xiàn)，未修飾IONzymes的擬過氧化物酶活性較低，其Vmax/Km在以過氧化氫為變量時(shí)為3.21×10-7/s。經(jīng)維生素B6修飾后, VB6-IONzymes的過氧化物酶活性明顯提高,Vmax/Km達(dá)到6.99×10-7/s(圖2A)。Vmax指最大反應(yīng)速度,Km指米氏常數(shù)。

為了進(jìn)一步確定經(jīng)維生素B6修飾的IONzymes對H2O2的催化能力，本研究用電子順磁共振波譜儀檢測了VB6-IONzymes催化H2O2產(chǎn)生羥基自由基的能力。由于在自然狀態(tài)下短時(shí)間內(nèi)H2O2是無法產(chǎn)生大量的羥基自由基，而過氧化物酶則可以加速這一反應(yīng)生成。結(jié)果顯示，在0.10 mol/L、pH值為4.50的醋酸鈉溶液中，在H2O2和BMPO存在情況下, VB6-IONzymes可以快速催化H2O2產(chǎn)生明顯的羥基自由基信號(圖2B), 這是由于VB6-IONzymes在酸性環(huán)境下具有擬過氧化物酶活性，能夠催化過氧化氫分解產(chǎn)生羥基自由基。

2.3 VB6-IONzymes對變異鏈球菌殺傷作用

本研究對比了經(jīng)維生素B6修飾前后IONzymes對變異鏈球菌的抑制情況。在實(shí)驗(yàn)條件下，未經(jīng)修飾的IONzymes對變異鏈球菌無明顯作用，而0.50 mg/mL VB6-IONzymes對變異鏈球菌抑制效果接近50%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖3。

A: VB6-IONzymes擬過氧化物酶動(dòng)力學(xué)擬合曲線; B: VB6-IONzymes EPR測定。

圖2 VB6-IONzymes擬過氧化物酶動(dòng)力學(xué)曲線與電子順磁共振波譜圖

A: IONzymes與VB6-IONzymes對S.mutans抑制作用，與VB6-IONzymes比較, ***P<0.001; B:S.mutans生物膜培養(yǎng)裝置;C: VB6-IONzymes協(xié)同1.00% H2O2抑制S.mutans生物膜干重，與VB6-IONzymes+1.00% H2O2比較, **P<0.01, ***P<0.001;D: VB6-IONzymes協(xié)同1.00% H2O2抑制S.mutans生物膜內(nèi)細(xì)菌增殖，與VB6-IONzymes+1.00% H2O2比較, ***P<0.001。

圖3 VB6-IONzymes抗變異鏈球菌與生物膜效果

2.4 VB6-IONzymes促進(jìn)低濃度H2O2對變異鏈球菌形成生物膜的抑制作用

本研究評估了VB6-IONzymes協(xié)同1.00% H2O2對變異鏈球菌生物膜的清除效果，在特定條件下分別對形成生物膜的變異鏈球菌數(shù)目以及生物膜干重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

經(jīng)過19、29、43 h這3個(gè)時(shí)點(diǎn)的處理后，在43 h時(shí)對各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，藥物協(xié)同組處理過的生物膜的干重顯著降低(P<0.01或P<0.001), 相比于陰性對照組下降了77.28%, 相比于單純使用1.00% H2O2組下降了46.16%, 表明VB6-IONzymes協(xié)同1.00% H2O2能夠顯著抑制變異鏈球菌形成的生物膜。同時(shí), VB6-IONzymes協(xié)同1.00% H2O2也能明顯抑制生物膜內(nèi)變異鏈球菌的數(shù)量。在經(jīng)過3次給藥后，生物膜內(nèi)變異鏈球菌殘留量驟減，增殖速度以及形成生物膜的能力顯著下降(P<0.001), 具有從根本上抑制生物膜形成的作用。見圖3。

3 討 論

納米酶作為過氧化物酶的模擬物，能夠在低濃度H2O2存在時(shí)，將其催化生成高活性的羥基自由基，目前被用于抗腫瘤與抗菌領(lǐng)域[14]。眾所周知，口腔細(xì)菌被包裹在具有保護(hù)作用的細(xì)胞外基質(zhì)，因此很難處理或除去。納米酶因具有過氧化物酶催化活性，能夠在酸性條件下催化H2O2轉(zhuǎn)化生成羥基自由基，降解生物膜并且快速有效地殺死生物膜中的細(xì)菌。

本研究主要利用羥基自由基的高抗菌活性，擬開發(fā)具有更好的抗口腔生物膜效果和口腔微環(huán)境穩(wěn)定性的新型抗菌材料[15-16]。本研究利用溶劑熱法成功地將IONzymes進(jìn)行維生素B6修飾得到VB6-IONzymes。本研究結(jié)果表明, IONzymes經(jīng)過維生素B6修飾后體積明顯變小，且酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)分析表明VB6-IONzymes過氧化物酶催化活性得到顯著增強(qiáng)。此外，對比IONzymes, VB6-IONzymes協(xié)同H2O2可發(fā)揮更強(qiáng)的抗口腔生物膜的效果，口腔生物膜干重與生物膜內(nèi)部殘留細(xì)菌均得到有效減少。