宋鵬濤 馬志紅 許麗敏 周凌燕 張建斌 平金良

肺癌是我國乃至世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，因缺乏有效的診斷標(biāo)志物造成其早期診斷率低及預(yù)后判斷難，一旦發(fā)現(xiàn)大部分已處于晚期，導(dǎo)致治療效果差、預(yù)后不良、病死率極高，嚴(yán)重威脅人類的健康[1]。隨著對炎癥與腫瘤生長相關(guān)關(guān)系研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)慢性感染和炎癥在促進(jìn)腫瘤發(fā)生和演化過程中起著十分重要的作用，被認(rèn)為是最重要的后天性和環(huán)境因素[2]。大量的研究結(jié)果均表明炎癥免疫系統(tǒng)的激活與癌癥的發(fā)生有關(guān)，以慢性炎癥為特點(diǎn)的腫瘤微環(huán)境，能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[3-4]。

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用，國內(nèi)外大量的研究表明其與肺癌的發(fā)生存在一定的相關(guān)性。何鳳蓮等[5]及高勝利[6]研究表明 Toll樣受體 4（Toll-like receptors 4，TLR4）蛋白的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的組織分化程度密切相關(guān)。筆者前期研究也表明TLR4和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常肺組織，因而進(jìn)一步采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）法和RT-PCR法研究TLR4及其相關(guān)信號通路關(guān)鍵因子在肺腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義，以期為肺腺癌的早期診斷和臨床預(yù)后評估提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年7月至2018年12月于本院手術(shù)治療的肺腺癌患者92例作為研究對象，其中男42例，女 50 例，年齡 30～78（58.0±22.5）歲。均經(jīng) 2 位病理科醫(yī)生確診，手術(shù)前均未接受過放射治療和化學(xué)藥物治療等處理。腫瘤組織標(biāo)本均按2009年國際抗癌聯(lián)盟（AJCC）TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期，其中Ⅰ、Ⅱ期53例，Ⅲ、Ⅳ期39例；低分化45例，高、中分化47例。并選擇其中30例距腫瘤5cm遠(yuǎn)的正常肺組織作為對照。

1.2 主要試劑 TLR4抗體（批號：3253-100）、髓樣分化因子 88（myeloid different iation factor88,MyD88）抗體（批號：3244R-100）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor 6,TRAF6）抗體（批號：3566R-100）均購自美國 BioVision公司，NF-κB抗體（批號：ab16502）、白介素-1 受體相關(guān)激酶-1（Interleukin-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1）抗體（批號：ab238）、IRAK4 抗體（批號：ab119942）均購自英國abcam公司。Super ScriptTMⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶（批號：11904018）購自美國Invitrogen公司。

1.3 TLR信號通路關(guān)鍵因子蛋白表達(dá)量檢測 將存檔的肺腺癌組織和正常肺組織標(biāo)本進(jìn)行切片，厚約4μm。采用免疫組化法檢測，操作步驟按檢測試劑盒說明書進(jìn)行：常規(guī)方法脫蠟，梯度乙醇（95%、85%、75%）脫水，抗原修復(fù)液（0.01M的枸櫞酸鈉緩沖液，pH6.0）修復(fù)2次，PBS洗滌3次，一抗（1∶2 000兔抗人）4℃過夜（陰性對照所用的一抗為正常羊血清），磷酸緩沖鹽溶液洗滌，加入二抗，37℃孵育30min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片后進(jìn)行觀察。TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1、IRAK4、TRAF6蛋白的免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參考Yu等[7]報(bào)道的方法，光學(xué)顯微鏡下觀察組織標(biāo)本的著色范圍與著色強(qiáng)度。TLR4、MyD88、IRAK1、IRAK4、TRAF6蛋白的陽性表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，NF-κB蛋白的陽性表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中有棕褐色或棕黃色顆粒沉淀。隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野，計(jì)算陽性細(xì)胞總數(shù)，按陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比計(jì)算分值：≤10%為1分，＞10%且≤50%為2分，＞50%且≤75%為3分，＞75%為4分。同時(shí)按照染色的強(qiáng)弱程度計(jì)算分值：陰性為1分，弱染色為2分，中等染色為3分，強(qiáng)染色為4分。上述兩種分值的乘積作為最終結(jié)果：＜4 分為－；4～7 分為＋；8～12分為＋＋；13～16 分為＋＋＋。＋＋和＋＋＋為高表達(dá)，－和＋為低表達(dá)。

1.4 TLR信號通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)水平檢測 采用TRIzol提取肺腺癌和正常肺組織的總RNA，進(jìn)而利用Super ScriptTMⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計(jì)引物進(jìn)行采用RT-PCR法檢測。所有樣品均分3管同時(shí)擴(kuò)增，計(jì)算單個(gè)樣品的循環(huán)閾值（Cycle threshold,CT）值并取平均值，TLR信號通路關(guān)鍵因子mRNA的表達(dá)水平采用 2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織和正常肺組織TLR信號通路關(guān)鍵因子蛋白表達(dá)的比較TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1、IRAK4蛋白在肺腺癌組織中的高表達(dá)率分別為76.09%（70/92）、70.65%（65/92）、67.39%（62/92）、68.47%（63/92）、64.13%（59/92），在正常肺組織中的高表達(dá)率分別為 16.67%（5/30）、13.33%（4/30）、10.00%（3/30）、13.33%（4/30）、6.67%（2/30），兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。TRAF6蛋白在肺腺癌組織中的高表達(dá)率為 20.65%（19/92），與正常肺組織的 20.00%（6/30）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1（插頁）。

2.2 不同臨床病理特征肺腺癌患者肺腺癌組織中TLR信號通路關(guān)鍵因子蛋白表達(dá)強(qiáng)度的比較 不同性別、年齡、腫瘤大小、分化程度患者TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1、IRAK4蛋白比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），而不同程度淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者上述蛋白比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。不同性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者TRAF6蛋白比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 肺腺癌組織和正常肺組織TLR信號通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)水平比較 肺腺癌組織中TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1和IRAK4 mRNA表達(dá)水平均明顯高于正常肺組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而TRAF6 mRNA的表達(dá)水平與正常肺組織比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 2。

3 討論

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多階段、多系統(tǒng)共作用的復(fù)雜過程，其主要包括細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化、抗凋亡、促生長、免疫逃脫及侵襲與轉(zhuǎn)移等這幾個(gè)過程[3]。近年來的臨床和流行病學(xué)研究均表明在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中慢性感染和炎癥起著十分重要的作用，尤其炎癥是腫瘤產(chǎn)生過程的一個(gè)關(guān)鍵因子。

TLR是介導(dǎo)免疫反應(yīng)過程中的一個(gè)重要信號通路，其主要通過識別病原相關(guān)分子模式激活機(jī)體免疫反應(yīng)，大量的研究表明TLR介導(dǎo)的信號通路與癌癥的發(fā)生、發(fā)展有著密切的相關(guān)性，如胃癌、腸癌、乳腺癌的發(fā)生均與TLR表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)[2-4]。TLR4是與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展最為密切的TLR家族成員之一，在對肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胃癌等癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展及其生長轉(zhuǎn)移研究過程中也發(fā)現(xiàn)TLR4多表達(dá)于上述腫瘤細(xì)胞，且其與生長轉(zhuǎn)移存在一定的關(guān)聯(lián)性[8-9]。Chen等[10]利用細(xì)菌組成成分及內(nèi)源性配基進(jìn)行刺激發(fā)現(xiàn)TLR激活NF-κB從而刺激了內(nèi)部促炎因子的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長及化療藥物抗藥性的產(chǎn)生。Kelly等[11]利用LPS刺激人卵巢癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可激活NF-κB信號通路，激活下游促炎因子的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)，該研究還發(fā)現(xiàn) TLR4主要表達(dá)于人卵巢癌細(xì)胞表面。本研究結(jié)果表明，肺腺癌組織中TLR4、NF-κB蛋白的陽性高表達(dá)率分別為76.09%（70/92）和70.65%（65/92），顯著高于正常肺組織，TLR4、NF-κB 在肺腺癌組織中的表達(dá)上調(diào)可能參與病程的發(fā)生、發(fā)展。此外，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，肺腺癌組織中TLR4、NF-κB蛋白的高表達(dá)與肺腺癌患者的分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有較強(qiáng)的相關(guān)性，提示上調(diào)表達(dá)的TLR4、NF-κB可能與患者的預(yù)后相關(guān)，這與Inoue等和Pikarsky等[12-13]的研究結(jié)果一致。

表1 不同臨床病理特征肺腺癌患者肺腺癌組織中TLR信號通路關(guān)鍵因子蛋白表達(dá)強(qiáng)度的比較

續(xù)表

眾所周知，MyD88是TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最重要的銜接蛋白。它首先與IRAK4結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)IRAK4介導(dǎo)的IRAK1磷酸化，之后被高磷酸化的IRAK1進(jìn)入胞質(zhì)募集可溶性TRAF6，進(jìn)而激活其相關(guān)的2種信號通路[14]。為進(jìn)一步確定TLR信號通路關(guān)鍵因子在肺腺癌組織中的表達(dá)情況及相關(guān)性，筆者對其下游信號通路關(guān)鍵因子進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)MyD88、IRAK1、IRAK4在肺腺癌組織均呈高表達(dá)。查道德等[15]對LPS刺激的肺癌細(xì)胞株（A549）和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株（H1299）研究發(fā)現(xiàn)，可通過誘導(dǎo)TLR4信號通路，刺激免疫抑制因子的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的免疫逃逸。本研究結(jié)果也提示肺腺癌組織中TLR4和NF-κB的表達(dá)水平顯著高于正常肺組織，同時(shí)，其下游通路關(guān)鍵因子MyD88、IRAK1、IRAK4的表達(dá)水平也相應(yīng)的隨著前兩者的升高而升高，表明MyD88、IRAK1、IRAK4的表達(dá)受其調(diào)控，這也從另一角度表明其可通過TLR4/NF-κB信號通路誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而使肺腺癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增長。同時(shí)，本研究結(jié)果也提示TRAF6的表達(dá)水平與之并無顯著的相關(guān)性，但最近的多項(xiàng)研究表明，TRAF6在多種腫瘤的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[16]，同時(shí)，Sun等[17]和Han等[18]敲除TRAF6基因后發(fā)現(xiàn)食管癌細(xì)胞的增殖明顯的受到了抑制作用，這表明TRAF6參與了食管癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲作用，但本研究結(jié)果表明TRAF6的表達(dá)與肺腺癌的發(fā)生無顯著相關(guān)性，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究從不同角度驗(yàn)證了TLR信號通路關(guān)鍵因子 TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1、IRAK4 在肺腺癌中高表達(dá)與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，表達(dá)上調(diào)的信號通路關(guān)鍵因子參與了肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后等進(jìn)程，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。