蔡煒龍 余勝 汪偉民 樓能

膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1-2]。由于缺乏早期臨床表現(xiàn)，膽囊癌患者確診時往往已是中晚期，淋巴結轉移發(fā)生率高，失去根治性手術機會，預后差[3]。因此，尋求新的膽囊癌診療靶點尤為重要。miRNA是一類非編碼小RNA分子，幾乎參與了細胞生命周期的全過程，可作為轉錄后調節(jié)因子調控靶基因的表達[4-6]。目前有研究表明，miR-3662在急性白血病、黑色素瘤及肝癌等惡性腫瘤中異常表達，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[7-9]。本研究擬通過檢測miR-3662在人膽囊癌組織中的表達水平，并觀察其對人膽囊癌細胞增殖能力的影響，從而探討miR-3662作為膽囊癌新的治療靶點的可能性，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑 30對人膽囊癌組織及其癌旁組織標本源自2015年至2019年本院普外科接受手術治療、并經術后病理證實為原發(fā)性膽囊癌的30例患者；SPF級BALB/c雄性裸鼠8只，4～6周，體重（25.67±3.47）g，購于中國科學院上海動物實驗中心。人膽囊癌細胞株GBC-SD和SGC-996由中國科學院上海生命研究院細胞資源中心提供，DMEM培養(yǎng)基和FBS購于美國Gibco公司，miRNA反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR（qRTPCR）試劑盒購于大連Takara公司，miR-NC和miR-3662購于上海拓然生物科技有限公司，脂質體2000（Lipofectamine 2000）購于美國Invitroen公司，CCK-8試劑盒、結晶紫購于上海碧云天生物科技有限公司。本研究經本院倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 人膽囊癌組織及其癌旁組織中miR-3662相對表達量檢測 采用qRT-PCR法。研磨膽囊癌組織及其癌旁組織，加入Trizol提取組織或細胞的總RNA，檢測RNA的濃度和純度；按miRNA反轉錄試劑盒說明書將組織 RNA按照 37℃、60min，85℃、5min的程序反轉成miRNA，用qRT-PCR試劑盒進行組織樣本RNA中miR-3662相對表達量的檢測，其相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.2.2 細胞分組、培養(yǎng)及轉染 人膽囊癌細胞株GBCSD和SGC-996在含有10%DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放入5%CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。將細胞分為miR-3662組和miR-NC組，其中miR-3662組細胞轉染miR-3662，miR-NC細胞轉染miR-NC。分別將GBC-SD和SGC-996鋪于6孔板中，24h后根據(jù)試劑盒說明書，采用Lipofectamine 2000轉染兩組細胞，每6孔板內轉染50nmol miRNA，轉染6h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；轉染48h后收集細胞進行后續(xù)實驗。提取細胞RNA后，采用qRT-PCR法檢測兩組細胞中miR-3662的相對表達量，每次實驗重復3次，取平均值。

1.2.3 兩組細胞增殖能力檢測 采用CCK-8實驗。將轉染48h后的細胞進行胰酶消化、離心、重懸后計數(shù)，將細胞接種于96孔板中，每孔1×103個細胞，每組設置4個復孔，放入5%CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。分別于6h、1、2、3、4、5d 加入 20%CCK-8，37℃避光培養(yǎng) 2h 后，使用酶標儀檢測450nm處吸光度（A）值來表示細胞增殖能力，并根據(jù)A450值繪制細胞生長曲線，上述實驗重復3次，取平均值。

1.2.4 平板克隆形成實驗 將轉染48h后的細胞進行胰酶消化、離心、重懸后計數(shù)，將兩組細胞分別接種于6孔板中，每孔500個細胞，每組設置3個復孔，放入5%CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。持續(xù)7d，每3d更換一次培養(yǎng)基。7d后棄培養(yǎng)基，每孔加入1ml 4%多聚甲醛固定后以結晶紫染色。將培養(yǎng)皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞集落形成數(shù)，拍照并采用Image J軟件進行計數(shù)。

1.2.5 裸鼠皮下移植瘤實驗 將8只裸鼠按隨機數(shù)字表法分為實驗組和陰性對照組，每組4只，其中實驗組裸鼠接種miR-3662組細胞，陰性對照組裸鼠接種miR-NC組細胞。將轉染48h后的細胞進行胰酶消化、離心、重懸后計數(shù)，分別配置成濃度為1×107個/ml的細胞懸液，用1ml的注射器沿裸鼠右側肋弓接種至腋下，之后每周觀察裸鼠皮下移植瘤生長情況并進行測量記錄。接種4周后，采用頸椎脫位法處死裸鼠。將腫瘤完整剝離下來后，兩組裸鼠的腫瘤放在一起進行拍照，將瘤體進行稱重，記錄并統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人膽囊癌組織及其癌旁組織中miR-3662相對表達量比較 miR-3662在人膽囊癌組織中的相對表達量0.06±0.02，明顯低于癌旁組織的 0.16±0.05，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 兩組細胞中miR-3662相對表達量比較 miR-3662組GBC-SD和SGC-996的miR-3662的相對表達量較miR-NC組均明顯上調，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表 1。

表1 兩組細胞中miR-3662的相對表達量比較

2.3 兩組細胞增殖能力比較 加入CCK-8后第5天時，與miR-NC組相比，miR-3662組細胞A450值明顯為小，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

2.4 兩組細胞集落形成數(shù)比較 miR-3662組GBC-SD和SGC-996的集落形成數(shù)較miR-NC組均明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖2（插頁）、表2。

圖1 兩組細胞A450值比較（與miR-NC組比較，*P＜0.05）

表2 兩組集落形成數(shù)比較（個）

2.5 兩組細胞移植瘤質量比較 實驗組裸鼠皮下移植瘤質量（0.057±0.012）g，較陰性對照組（0.210±0.042）g明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 兩組移植瘤體積比較

3 討論

近年來，膽囊癌的發(fā)病率逐年升高，中位生存時間僅有不到20個月，預后極差[10-11]。盡管目前膽囊癌在化學治療、靶向治療和免疫治療等藥物研究上有所突破，但由于腫瘤耐藥性等原因，治療效果仍較差。因此，迫切需要新的膽囊癌分子靶點應用于臨床。目前已有超過1 400多條miRNA被發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的生物學功能，可通過類似癌基因、抑癌基因或其他方式調控腫瘤細胞的增殖、凋亡和遷移等活動[12-13]。miRNA在膽囊癌中也發(fā)揮著重要作用，研究表明，大量miRNA 如 miR-29c-5p、miR-143-3p、miR-139-5p 等在膽囊癌中差異表達，調控膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展[14-16]。miR-3662在多種惡性腫瘤中表達失調，Powrózek等[17]比較了90例肺癌患者的血漿樣本與85例健康對照組的血漿樣本，發(fā)現(xiàn)miR-3662在肺癌患者中的表達明顯上調，有望成為潛在的肺癌生物標志物。Maharry等[18]報道發(fā)現(xiàn)miR-3662的表達豐度越高，造血組細胞（尤其是紅系譜系）中的集落形成數(shù)越多，而急性髓樣白血病細胞中并無miR-3662的表達，且miR-3662過表達具有抗白血病的作用。Chen等[9]發(fā)現(xiàn)miR-3662在肝癌細胞中表達下調，通過作用于下游靶基因HIF-1α調控瓦博格效應和肝癌的進展。這些結果均表明miR-3662可能成為新的惡性腫瘤標志物和藥物靶點。

本研究筆者檢測了30對膽囊癌組織和癌旁組織中miR-3662的相對表達量，發(fā)現(xiàn)相比于癌旁組織，miR-3662在膽囊癌組織中的相對表達量明顯下調。在膽囊癌細胞中轉染miR-3662后，qRT-PCR顯示GBC-SD和SGC-996細胞中miR-3662的相對表達量明顯上調。通過CCK-8細胞增殖實驗和平板克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，過表達miR-3662后GBC-SD和SGC-996細胞的體外增殖能力明顯下調。裸鼠皮下移植瘤實驗結果顯示miR-3662過表達后移植瘤體積明顯縮小，且質量更小，提示miR-3662可在體內抑制膽囊癌細胞的增殖能力。本研究表明，miR-3662可能作為抑癌miRNA在膽囊癌中發(fā)揮生物學功能，體內外實驗均表明miR-3662可以抑制膽囊癌細胞的增殖能力，提示其可為膽囊癌的新的分子靶點，但其下游調控的分子及信號通路仍有待進一步研究。