吳鑌莎 余寧 盧佳敏 李小青 周怡池 萬凌屹 謝遲遲 張娟文 鄭若姮

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種以持續(xù)排卵障礙、高雄激素血癥及胰島素抵抗（insulin resistance，IR）為特征的生殖內(nèi)分泌常見疾病，其發(fā)病率在育齡期婦女中達(dá)5%～10%，占不排卵性不孕癥的50%～70%[1]。PCOS以不孕、多毛、無排卵及月經(jīng)不調(diào)等為主要臨床表現(xiàn)，同時(shí)伴有特征性的血清生化指標(biāo)改變，如雄激素及促黃體激素（luteinizing hormone，LH）水平上升但卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）水平正常等。PCOS是一種多因性疾病，與遺傳[2]、基因多態(tài)性[3]、代謝綜合征[4]及環(huán)境[5]等因素密切相關(guān)，但具體機(jī)制仍然未明，且缺少特異性的分子生物學(xué)診斷標(biāo)志物。本研究聯(lián)合長鏈非編碼核糖核酸（long noncoding ribonucleic acid，LncRNA）表達(dá)芯片初篩及實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）驗(yàn)證，構(gòu)建 PCOS特異性表達(dá)譜，進(jìn)一步采用生物信息學(xué)方法推測其可能的下游基因通路，為PCOS分子生物學(xué)診斷方法的研發(fā)提供新思路。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2017年1月1日至2018年6月30日在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院就診的50例PCOS患者為PCOS組，同期在體檢中心常規(guī)體檢的50例健康人群作為對照。PCOS的診斷依據(jù)鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)（至少滿足以下3條標(biāo)準(zhǔn)中的2條）：（1）排卵減少或不排卵；（2）臨床雄激素過高征，包括多毛、痤瘡、男性化的脫發(fā)以及高雄激素血癥；（3）B超檢查見一側(cè)或雙側(cè)卵巢直徑2～9mm的卵泡≥12個(gè)和(或)卵巢體積≥10cm3。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，兩組對象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血清RNA提取 采集所有對象血清5ml，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｃ坷⊙?100～500μl，加入 800μl Trizol-LS，振蕩混勻；加入 10μl 0.1pmol/μl的 miRNA156，振蕩混勻，靜置15min。加入200μl氯仿，劇烈振蕩，靜置15min；16 000g離心20min。取上清液，加入400μl水飽和酚，振蕩混勻，靜置1～2min；16 000g離心3min。取上清液，加入200μl水飽和酚和200μl氯仿，振蕩混勻，靜置1～2min；16 000g離心 3min。取上清液（約 800μl），分至兩管，每管加入1ml異丙醇，振蕩混勻，靜置于冰上20min；4℃、16 000g離心20min。棄上清液，每管加入500μl 75%焦碳酸二乙酯（DEPC）-乙醇，振蕩后16 000g離心20min。棄上清液，用吸水紙?jiān)谠嚬芸趯⑹Ｓ嘁后w吸干，開蓋晾干（若液體仍較多，可用移液槍將液體吸出，但應(yīng)注意不要碰到管底）。每管加入15μl DEPC水，靜置待RNA溶解后，將兩管合并。

1.2.2 LncRNA表達(dá)譜檢測 從PCOS組、對照組分別隨機(jī)選取3例血清標(biāo)本進(jìn)行LncRNA表達(dá)譜檢測。使用Nanodrop測定提取RNA在分光光度計(jì)260、280、230nm處的吸光度，以進(jìn)行濃度測定與純度評估。用甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。采用人類8*60KLncRNA芯片進(jìn)行信號(hào)采集，該芯片包含有30 586個(gè)人LncRNA位點(diǎn)（Arraystar，Rockville，Maryland，USA）。首先根據(jù)單色微陣列基因表達(dá)分析流程（Agilent Technology，Santa Clara，USA）進(jìn)行樣本的標(biāo)記與序列雜交，再利用安捷倫圖像獲取軟件11.0.1.1進(jìn)行圖像分析。后續(xù)的分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化與數(shù)據(jù)處理在GeneSpring GX v12.1軟件（Agilent Technologies）中進(jìn)行。聯(lián)合分析組間t檢驗(yàn)（P＜0.05）、多重假設(shè)檢驗(yàn)（FDR＜0.05）和倍數(shù)變化（＞2或＜0.5）的結(jié)果，得到顯著性差異的LncRNA表達(dá)譜。進(jìn)一步以熱圖形象化顯示可區(qū)分PCOS患者和健康人群的差異表達(dá)LncRNA。

1.2.3 LncRNA的qRT-PCR驗(yàn)證 選取包含接受芯片檢查對象在內(nèi)的PCOS患者和健康人群各6例，使用Prime Script RTreagent試劑盒（TakaRa，大連，中國）針對熱圖得到的差異表達(dá)LncRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。U6核小RNA（snRNA）進(jìn)一步擴(kuò)增，作為內(nèi)參。將每個(gè)LncRNA的絕對表達(dá)量除以U6 snRNA的絕對表達(dá)量，得到LncRNA的相對表達(dá)量。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 將芯片得到的顯著上調(diào)和下調(diào)的LncRNA，利用starbase網(wǎng)站（http://starbase.Sysu.edu.cn）進(jìn)行下游調(diào)控靶基因預(yù)測。將預(yù)測得到的信使RNA（mRNA）進(jìn)行基因本體注釋（gene ontology，GO）富集分析，以得到潛在的共同細(xì)胞生物學(xué)功能。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次，正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組對象一般資料比較 與對照組相比，PCOS組體重指數(shù)（body mass index，BMI）、睪酮、甘油三酯、C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）水平及胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)模型（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR）明顯增高，雌二醇水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；兩組對象年齡、膽固醇水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

2.2 PCOS患者LncRNA表達(dá)譜的構(gòu)建 與對照組比較，PCOS組患者血清中分別有351、217種顯著上調(diào)和下調(diào)的LncRNA（符合變化系數(shù)≥2.0，P＜0.05）。進(jìn)一步作聚類分析，發(fā)現(xiàn)包含顯著上調(diào)的11種LncRNA和顯著下調(diào)的8種LncRNA的數(shù)據(jù)集可以成功區(qū)分PCOS患者和健康人群，見圖1（插頁）。

2.3 差異表達(dá)LncRNA的驗(yàn)證 通過qRT-PCR驗(yàn)證熱圖中所列LncRNA，與對照組比較，在PCOS組上調(diào)的LncRNA中，ENST00000433673和 CTC-338M123未達(dá)到顯著性差異；在PCOS組下調(diào)的LncRNA中，ENST00000569039未達(dá)到顯著性差異。qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步支持LncRNA芯片作為初篩方法的靈敏度和特異度。

表1 兩組對象一般資料比較

2.4 LncRNA下游靶基因的GO富集分析 選取PCOS患者LncRNA芯片中顯著上調(diào)和下調(diào)的LncRNA各20個(gè)，輸入Starbase網(wǎng)站進(jìn)行下游基因預(yù)測，得到的靶基因作進(jìn)一步GO富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)LncRNA預(yù)測的mRNA共涉及11個(gè)相關(guān)GO生物學(xué)功能，包括細(xì)胞生長和體積的負(fù)調(diào)控、N-乙酰葡萄胺/葡萄胺代謝過程、氨基糖代謝過程、細(xì)胞組分大小和定位調(diào)控、細(xì)胞腔；顯著下調(diào)LncRNA預(yù)測的mRNA共涉及20個(gè)相關(guān)GO生物學(xué)功能，包括基因及表觀遺傳學(xué)負(fù)調(diào)控、細(xì)胞活化調(diào)控、細(xì)胞周期、淋巴血管發(fā)育、鈣離子反應(yīng)、染色質(zhì)重塑、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、干擾素r生物合成過程正調(diào)控、血細(xì)胞發(fā)生、嘌呤堿生物合成、結(jié)合調(diào)控、mRNA接合位點(diǎn)選擇、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、轉(zhuǎn)錄、白細(xì)胞活化調(diào)控，見圖2。

圖2 差異表達(dá)LncRNA所預(yù)測靶基因的GO富集分析（a：顯著上調(diào)LncRNA所預(yù)測的下游mRNA；b：顯著下調(diào)的LncRNA所預(yù)測的下游mRNA）

3 討論

當(dāng)前PCOS的診斷多采用2003年鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)[6]。各項(xiàng)研究表明 PCOS除引起生殖功能和代謝功能的異常外，還可增加子宮內(nèi)膜癌、血脂異常、心血管疾病和2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。有報(bào)道指出，PCOS可并發(fā)雄激素性脫發(fā)、睡眠呼吸暫停、抑郁、妊娠期高血壓、先兆子癇、非酒精性脂肪性肝病等[7]，病情嚴(yán)重時(shí)可能影響女性一生的健康。由此可見，早期診斷和治療是至關(guān)重要的。因此，構(gòu)建PCOS非侵入性的分子標(biāo)志物群，不僅有助于提高疾病的臨床檢出率，實(shí)現(xiàn)早期診療，對于PCOS的研究、減輕社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)也有重要意義。

LncRNA是一類長度介于200～100 000個(gè)核苷酸的非編碼RNA[8]。目前研究認(rèn)為，它在表觀遺傳學(xué)水平、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平上廣泛地參與腫瘤調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而在復(fù)雜的腫瘤調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用[9]。此外，LncRNA通過調(diào)控下游靶基因參與各種病理、生理過程（如腫瘤發(fā)生、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管生成等）也是當(dāng)前學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)。然而，LncRNA在PCOS中的研究并不多見，且主要集中于其下游調(diào)控機(jī)制的研究（如LncRNA-GS5促進(jìn)PCOS患者的IR[10]、LncRNA介導(dǎo)的內(nèi)源競爭RNA網(wǎng)絡(luò)在PCOS患者卵母細(xì)胞核成熟中的作用[11]）或組織LncRNA表達(dá)譜的變化（如PCOS患者顆粒細(xì)胞[12]和卵丘細(xì)胞[13]）。

血清存在著多種蛋白、糖質(zhì)、色素、電解質(zhì)、無機(jī)鹽，同時(shí)還匯集了來自全身組織器官的多種信號(hào)分子。目前組織中LncRNA分子已被證實(shí)是一類新型疾病標(biāo)志物，而血清中LncRNA是否存在同樣的效能，是當(dāng)前研究的最熱點(diǎn)問題之一。Chen等[14]最早闡明了血清中存在穩(wěn)定的miRNA（一種短鏈RNA）并且在不同疾病之間miRNA的表達(dá)譜存在有顯著性差異，支持血清中非編碼RNA存在的可能。此后，血清LncRNA在食管鱗癌[15]、膀胱癌[16]和乳腺癌[17]中的預(yù)測作用陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，使得血清LncRNA表達(dá)譜在疾病中的作用日益受到重視。血清LncRNA作為新型疾病標(biāo)志物，具有檢出譜系廣、靈敏度高、檢測成本低、取材方便、樣本易存放（-20℃存放即可）等優(yōu)點(diǎn)，該方法可廣泛用于疾病普查等相關(guān)工作，成為了早期診斷疾病的有效手段。但是筆者檢索了國內(nèi)外文獻(xiàn)，關(guān)于血清LncRNA在PCOS中的研究未見報(bào)道。

本研究通過LncRNA表達(dá)譜研究，闡明了PCOS患者差異性表達(dá)的LncRNA；并進(jìn)一步作聚類分析，發(fā)現(xiàn)包含顯著上調(diào)的11種LncRNA和顯著下調(diào)的8種LncRNA的數(shù)據(jù)集可以成功區(qū)分PCOS患者和健康人群。針對聚類分析的結(jié)果，進(jìn)一步采用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)16種LncRNA差異表達(dá)與芯片結(jié)果一致，符合率達(dá)84.2%。在這些差異表達(dá)的LncRNA中，既往研究提示CCAT1與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如其通過介導(dǎo)下游Runx2基因參與人宮頸癌的增殖和上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變[18]；XLOC家族中的006390被報(bào)道可以通過穩(wěn)定c-Myc來促進(jìn)胰腺癌發(fā)生和谷氨酸鹽代謝[19]；LncRNA-ROR可以通過調(diào)節(jié)miRNA-145/FSCN1通路促進(jìn)食管癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤[20]。生物信息學(xué)分析結(jié)果提示，這些差異表達(dá)的LncRNA下游調(diào)控基因的生物學(xué)功能涵蓋細(xì)胞生長、活化、表觀遺傳學(xué)調(diào)控等，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究系統(tǒng)闡述了PCOS患者血清特異性LncRNA表達(dá)譜，并對熱圖分析產(chǎn)生的差異LncRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，進(jìn)一步對預(yù)測的下游mRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過GO富集分析找到若干關(guān)鍵基因功能，為PCOS非侵入性診斷提供分子生物學(xué)標(biāo)志物。但本研究也存在一些不足：（1）PCOS患者血清LncRNA表達(dá)譜測定的樣本數(shù)偏少，雖經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證，但仍可能會(huì)發(fā)生較大偏倚，無法充分反映目標(biāo)人群情況；（2）筆者預(yù)測了差異表達(dá)程度最高的20個(gè)LncRNA的下游mRNA，但仍需要進(jìn)一步qRT-PCR驗(yàn)證，同時(shí)擴(kuò)大驗(yàn)證進(jìn)行預(yù)測下游mRNA的LncRNA范圍；（3）僅采用GO富集分析LncRNA下游mRNA的生物信息學(xué)功能，后續(xù)可針對其KEGG通路作進(jìn)一步分析。