李靖 翟博宇 朱曉藝 杜嘉楠 吳晨薇 葉穎萱 文藝 李婧妍 牛鑫鑫 曾祥偉 梁冬瑩

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150000)

模式識別受體(PRRs)是一類高度保守，主要表達(dá)于天然免疫細(xì)胞，可以識別一種或多種病原體保守結(jié)構(gòu)分子，即病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)的識別分子[1]。PRRs是能夠快速識別病毒、細(xì)菌和真菌等病原體感染，啟動天然免疫應(yīng)答的關(guān)鍵[2]，其包括Toll樣受體(TLRs)、視黃酸誘導(dǎo)型基因I樣受體(RLRs)、核苷酸結(jié)合寡聚化域樣受體(NLRs)、C型凝集素受體(CLRs)[3-4]。TLRs是進化上高度保守而古老的PRRs，幾乎存在于所有的多細(xì)胞生物中[5-6]。其中Toll樣受體7(TLR7)主要分布在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器中，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)溶酶體、內(nèi)體等[7-8]，識別喹啉咪唑派生物、RNA病毒的單鏈RNA、合成聚尿苷酸RNA、某些小的干擾RNA[9]，在抗病毒的天然免疫中發(fā)揮重要作用[10]。目前，哺乳動物的Toll樣受體的研究，已經(jīng)取得了許多突破和進展。但是，與哺乳類TLR7(hTLR7)相比，禽類TLR7(chTLR7)額外多了3個亮氨酸富集重復(fù)區(qū)(LRR)，致使其識別的配體有所差異[11]；另外，與hTLR7相比，chTLR7的大部分激動劑不能引起I型干擾素的表達(dá)上調(diào)[12]；這些都表明禽類和哺乳類TLRs之間是有差異的。

在實踐中，對于鳥類，尤其是野生鳥類的TLRs還知之甚少。野鳥作為病毒的重要載體，對許多病原體微生物具有較強的耐受能力；很多病毒只是攜毒而不表現(xiàn)出明顯癥狀，而且野鳥的遷徙行為更是大大增加了病毒的活動范圍和流動性。因此，為了了解TLRs在野鴨先天性免疫中的作用，本研究以綠頭鴨(Anasplatyrhynchos)為樣本，克隆了TLR7基因，并進行了序列分析和表達(dá)譜的測定，為進一步研究野鴨TLR7與機體先天性免疫、抗感染機制、野鳥疾病防控提高參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠頭鴨樣品來源于國家野生鳥類疾病監(jiān)測站?？俁NA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄引物(Oligo(dT))、逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、重組RNA酶抑制劑、高保真聚合酶、DNA聚合酶、DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)記、連接酶、T載體克隆試劑盒(pMDTM18)、加脫氧腺嘌呤核糖核苷酸(dA)試劑盒、熒光定量試劑盒、大腸桿菌DH5α均購自大連寶生物(TaKaRa)公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自杭州博日(BioFlux)公司；常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進口分析純產(chǎn)品。

1.2 綠頭鴨總RNA提取和cDNA的合成

采集綠頭鴨的心、肝、脾、肺、腎、腸試樣，進行總RNA提取，將試樣各轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷研缽，加入液氮研磨至粉末狀；隨后采用特里佐爾法(Trizol法)提取RNA，將RNA溶解于20 μL焦碳酸二乙酯水中，并將上述RNA模板(5 μL)加入1 μL反轉(zhuǎn)錄引物(Oligo(dT))，70 ℃水浴10 min。冰上急冷2 min，隨后將上述樣品液加入到含有2 μL 5倍反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、3 μL脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、0.5 μL重組RNA酶抑制劑(RRI)、0.5 μL反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)的體系中，旋渦混合后，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀42 ℃反應(yīng)1 h、70 ℃反應(yīng)15 min，獲得的cDNA模板-20 ℃保存?zhèn)溆?。剩余樣品置于冰?80 ℃保存。

1.3 TLR7基因的克隆測序

引物設(shè)計：根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)建立的DNA序列數(shù)據(jù)庫(GenBank)上公布的綠頭鴨的TLR7序列，用引物設(shè)計軟件(Oligo7)設(shè)計出特異性全長引物(TLR7-F、TLR7-R)、熒光定量引物(qTLR7-F、qTLR7-R)，β-肌動蛋白-F、β-肌動蛋白-R由文獻獲得[13](見表1)。

PCR擴增：采用巣式PCR的方法連續(xù)擴增2次，2次PCR的反應(yīng)條件相同，第二次反應(yīng)的模板為第一次反應(yīng)的產(chǎn)物。第一次反應(yīng)以綠頭鴨的脾的cDNA為模板，反應(yīng)體系——2倍高保真酶預(yù)混液12.5 μL、TLR7-F 1 μL、TLR7-R 1 μL、雙蒸水9 μL、模板2 μL。反應(yīng)條件——98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s、59 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。2次PCR的反應(yīng)條件相同。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。

目的基因的克隆測序：將綠頭鴨TLR7基因的膠回收產(chǎn)物末端進行加脫氧腺嘌呤核糖核苷酸(dA)反應(yīng)，體系——膠回收產(chǎn)物8 μL、10倍緩沖液1 μL、脫氧腺苷三磷酸(dATP)0.5 μL、加dA的酶0.5 μL。65 ℃水浴10 min，然后將上述產(chǎn)物連接在pUC18構(gòu)建的高效TA克隆載體(PMD18-T)上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，通過菌落篩選陽性菌落進行菌落PCR，體系——10倍PCR緩沖液(含Mg2+)2.5 μL，dNTP 1 μL，TLR7-F、TLR7R各1 μL，DNA聚合酶(rTaq)0.25 μL，雙蒸水19 μL，細(xì)菌液1 μL。PCR循環(huán)條件——95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min。最后將陽性菌液送至吉林庫美生物科技有限公司進行測序。

表1 引物信息

1.4 生物信息學(xué)分析方法

使用依據(jù)局部比對算法的搜索工具(BLAST)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)分析獲得序列的同源性；使用MegAlign軟件(DNAstar，USA)進行基于氨基酸序列的序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析；運用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測工具(SMART)(http：//smart.embl-heidelberg.de)預(yù)測基因序列的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；使用分子進化遺傳分析軟件(MEGA 7.0.26)構(gòu)建鄰接法(N-J)進化樹。

1.5 TLR7在綠頭鴨體內(nèi)的組織表達(dá)譜

以上述提取的心、肝、脾、肺、腎、腸cDNA為模板進行熒光定量PCR反應(yīng)，以測量TLR7在綠頭鴨體內(nèi)的表達(dá)譜，以β-肌動蛋白為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCt法計算測試組TLR7基因與對照組中β-肌動蛋白的相對表達(dá)率；使用引物見表1，每個組織樣本設(shè)立3個重復(fù)孔，反應(yīng)體系——生物染料法熒光定量試劑(TB Green Premix Ex Taq Ⅱ)5 μL，qTLR7-F、qTLR7-R各0.2 μL，雙蒸水3.6 μL，cDNA 1 μL。為了驗證引物特異性，通過將樣品的溫度從55 ℃增加到100 ℃產(chǎn)生產(chǎn)物的解離曲線來判斷。

2 結(jié)果與分析

對綠頭鴨脾cDNA進行巣式PCR后，得到預(yù)期的目的條帶(見圖1)。將菌液PCR得到的陽性樣品送測序，對測序結(jié)果進行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)與綠頭鴨TLR7(GenBank號：DQ888644)同源性最高(99.84%)，確定擴增序列為TLR7基因，隨后將其提交至美國國家生物信息中心(NCBI)，登錄號為MK7039600。

綠頭鴨TLR7基因的開放式閱讀框架(ORF)全長為3 144 bp，編碼1047個氨基酸。SMART程序預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)果顯示(見圖2)，TLR7具有典型的TLRs結(jié)構(gòu)，由胞內(nèi)功能區(qū)(TIR)、跨膜區(qū)、胞外區(qū)三部分構(gòu)成，其中胞外區(qū)包含有信號肽序列、富含亮氨酸的重復(fù)C末端結(jié)構(gòu)域(LRR-CT)、亮氨酸富集重復(fù)區(qū)(LRR)，LRR有10個，與已有的研究相同[14]。運用同源性分析軟件(Megalign)，將TLR7與其它鳥類(家鴿、鴻雁，以及其它綠頭屬物種等)、哺乳類(智人、恒河猴、家鼠、褐鼠)、魚類(鯉魚、東方鲀)、兩棲類(爪蟾)的相關(guān)基因序列進行同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TLR7與鳥類同源性最高，均在85%以上，且與其它綠頭鴨屬的物種相關(guān)性在99%以上；其次是哺乳類，同源性在63.2%～68.3%之間；然后是兩棲類，同源性在62.2%～62.5%；與魚類同源性最低，在58.8%～60.0%。綠頭鴨TLR7與其它物種的氨基酸序列同源性趨勢與基因序列相同，由高到低依次為鳥類(82.2%～100.0%)、哺乳類(62.0%～66.7%)、兩棲類(61.0%～62.9%)、魚類(55.3%～57.6%)。

運用Mega 7中的N-J法構(gòu)建進化樹(見圖3)，可明顯看到形成4個單獨的族簇，同類物種間進化保守。在鳥類中，綠頭鴨TLR7與雁形目關(guān)系較近，而與鴿及原雞相差較遠(yuǎn)。

設(shè)脾的相對表達(dá)量為1.00，則綠頭鴨TLR7 mRNA在不同組織中的表達(dá)譜——脾為1.00、肺為0.13、腎為0.12、心為0.08、肝為0.28、腸為0.27，在脾中屬最高表達(dá)，在肝、腸中屬中表達(dá)，在肺和心中屬較低表達(dá)。

3 討論

當(dāng)病原微生物入侵機體后，分布在宿主與環(huán)境交界面的TLRs能夠快速識別和結(jié)合病原體的PAMPs，與配體結(jié)合后的TLRs發(fā)生構(gòu)象變化，開始募集下游相關(guān)的接頭分子，觸發(fā)下游信號通路的級聯(lián)反應(yīng)，從而激活免疫相關(guān)基因的表達(dá)[15-16]。TLR7是TLRs的重要組成部分，主要識別病毒RNA類的PAMPs，如甲型流感病毒[17]，在抗病毒的天然免疫中發(fā)揮重要作用[10]。本研究克隆出了野生綠頭鴨的TLR7全長，并進行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其具有典型的TLRs結(jié)構(gòu)，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)組成[18]；其基因序列和氨基酸序列與鳥類同源性最高，與哺乳類、兩棲類、魚類形成明顯的4個組簇，而同類物種間的進化則十分保守。對鳥類的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，其胞內(nèi)區(qū)高度保守，氨基酸突變主要集中在胞外區(qū)，胞外區(qū)的LRR重復(fù)序列具有典型的馬蹄鐵樣螺線管結(jié)構(gòu)[19]，負(fù)責(zé)PAMPs的識別，其空間結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化都會影響對PAMPs的識別[20]；可見不同鳥類間胞外區(qū)的差異，與其對不同病毒的易感性有關(guān)。

本研究對綠頭鴨的脾、肺、腎、心、肝、腸進行了實時熒光定量PCR(qPCR)測定，發(fā)現(xiàn)TLR7在各組織中普遍表達(dá)，TLR7在脾中表達(dá)最高，其次為肝和腸，最低為肺和心。而四川白鵝和北京鴨，則是在免疫組織和呼吸道中最高表達(dá)[14，21]。已有研究報道，H5N1感染后的番鴨中的TLR3的表達(dá)在脾和肺中下降[10]、抗性宿主鯉魚在感染呼長孤病毒后TLR3表達(dá)下降[22-23]；此外，還有報道，在慢性感染期間人口腔黏膜中的TLR2/4/5 mRNA均呈現(xiàn)出下調(diào)[24]、在慢性結(jié)腸炎感染的小鼠中檢測到腸道上皮細(xì)胞中TLR5表達(dá)下降[25]。綜上所述，該綠頭鴨在野外生活過程中已經(jīng)攜帶了相關(guān)病毒或者是某種病毒的抗性宿主，從而使肺中TLR7的表達(dá)量下降。

綜上所述，本研究成功克隆出了綠頭鴨TLR7(GenBank號：MK7039600)的全長，并對其進行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)MK7039600具有典型TLRs家族結(jié)構(gòu)特征，在同類物種中進化高度保守。同時，qPCR顯示TLR7在測試的組織中普遍分布。從學(xué)術(shù)角度，需要進一步研究的是TLR7在抗病毒反應(yīng)中的動態(tài)變化、作用機制，明確TLR7在綠頭鴨抗病毒過程中的作用，為野鳥疾病的防控提高參考。