王 雨，羅 璨，吉兆寧

乳腺癌的發(fā)病率很高，被認為是女性最常見的癌癥之一[1]。其中，三陰性乳腺癌(TNBC)易于復發(fā)且死亡率高，被認為是最嚴重的乳腺癌亞型[2]。包括外科手術、化學療法和放射療法在內的多種療法已被用于治療乳腺癌。然而，乳腺癌仍然是臨床治療中最具挑戰(zhàn)性的腫瘤之一?；瘜W療法是乳腺癌術后的標準治療方法，但化療藥物通常會引起不良作用和耐藥性。開發(fā)有效的天然抗腫瘤藥物對于克服耐藥性至關重要。鴉膽子的種子被用作傳統中藥，常用于治療瘧疾、痢疾和癌癥[3]。鴉膽子苦素D是從鴉膽子的果實中提取的一種類胡蘿卜素[4]。早期研究[5]表明，鴉膽子苦素D對胰腺癌、慢性粒細胞性白血病、肝細胞癌和骨肉瘤等具有抑制作用。能量代謝重組(EMR)是癌癥的最關鍵標志之一[6]。最近的研究[7]表明，EMR可能是乳腺癌靶向治療的潛在方向。目前尚無關于鴉膽子苦素D對腫瘤細胞能量代謝影響的研究。本研究探討鴉膽子苦素D在TNBC MDA-MB-231細胞能量代謝中的作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 MDA-MB-231細胞購自江蘇凱基生物科技有限公司(中國)。鴉膽子苦素D樣品(純度> 98%)(暨南大學中醫(yī)藥與天然產物研究所，中國)，二甲基亞砜(DMSO)(久億化學試劑有限公司，中國)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(Amresco，美國)，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco，美國)，青霉素/鏈霉素溶液、順鉑、BCA蛋白定量試劑盒、β-actin抗體和抗兔免疫球蛋白(凱基生物科技有限公司，中國)，葡萄糖試劑盒、乳酸試劑盒、ATP試劑盒、己糖激酶(HK)試劑盒、磷酸果糖激酶(PFK)試劑盒、丙酮酸激酶(PK)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(建成生物科技有限公司，中國)，PI3K抗體(Affinity，美國)，Akt和p-Akt抗體(武漢三鷹生物有限公司，中國)。CO2培養(yǎng)箱(Sanyo，日本)，分光光度計(Thermo Fisher，美國)，超聲裂解儀(新芝生物科技股份有限公司，中國)，高速冷凍離心機(Eppendorf，德國)，生物倒置顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 細胞培養(yǎng) 將MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素溶液的RPMI-1640培養(yǎng)基中。置于在37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中生長。每隔3 d傳代1次，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 鴉膽子苦素D配制 將鴉膽子苦素D溶解在DMSO中，并儲存在-20 ℃。使用前，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.4 MTT法測定細胞活力 將MDA-MB-231細胞接種到96孔板(5×103/孔)中并培養(yǎng)24 h，然后加入不同濃度的順鉑(1.56～25.00 μmol/L)和鴉膽子苦素D(1.56～25.00 μmol/L)培養(yǎng)24 h，設立不加藥物的對照組。隨后，每孔加入20 μL MTT溶液，4 h后，棄培養(yǎng)基并加入150 μL DMSO。最后，測量各組在490 nm處的吸光度(OD)值以評價細胞活力。細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.5 ATP濃度的測定 將細胞以1×105/mL的密度接種，并在37 ℃用不同濃度的鴉膽子苦素D(1、2、4 μmol/L)或0.1%DMSO(對照組)處理24 h。將細胞懸液以1 000 r/min離心5 min，并收集細胞沉淀。然后將細胞沉淀物用PBS洗滌，并用超聲儀裂解5 min。將細胞裂解液在4 ℃以12 000 r/min離心15 min，取上清液儲存在-80 ℃。使用ATP試劑盒測定細胞裂解液中的ATP含量，使用BCA蛋白質定量試劑盒對細胞裂解液進行定量。

1.6 葡萄糖消耗量和乳酸生成量測定 細胞以1×105/mL的密度接種。在37 ℃下用不同濃度的鴉膽子苦素D(1、2和4 μmol/L)或0.1%DMSO(對照組)處理24 h后收集培養(yǎng)基，并在-80 ℃保存。使用葡萄糖和乳酸試劑盒測定培養(yǎng)基中葡萄糖和乳酸的濃度。葡萄糖消耗量和乳酸生成量為24 h培養(yǎng)期開始和結束時培養(yǎng)基含量的改變量。

1.7 糖酵解關鍵酶活性測定 將細胞以1×105/mL的密度接種，并在37 ℃用不同濃度的鴉膽子苦素D(1、2、4 μmol/L)或0.1%DMSO(對照組)處理24 h。將細胞懸液以1 000 r/min離心5 min，然后收集細胞沉淀。然后將細胞沉淀用PBS洗滌，并用超聲儀裂解5 min。將細胞裂解液在4 ℃ 以12 000 r/min離心15 min，收集上清液，并儲存在-80 ℃。使用HK、PFK、PK和LDH試劑盒測定細胞裂解液中的HK、PFK、PK和LDH活性，使用BCA蛋白定量試劑盒測定細胞裂解液中的蛋白質濃度。

1.8 Western blotting分析蛋白表達 使用總蛋白提取試劑盒提取MDA-MB-231細胞的總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒分析樣品的總蛋白濃度。各組蛋白樣品通過10%SDS-PAGE分離，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后用TBST洗滌3次。隨后，將膜與PI3K(1∶1 000)、Akt(1∶5 000)、p-Akt(1∶5 000)和β-actin(1∶400)抗體在4 ℃孵育過夜。然后將膜與抗兔IgG(1∶2 000)孵育1 h，用增強的化學發(fā)光法染色，使用G:BOX chemiXR5成像，并使用Gel-Pro32軟件進行灰度分析。以β-actin作為內參。

1.9 統計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 不同濃度鴉膽子苦素D抑制MDA-MB-231細胞活力的比較 鴉膽子苦素D處理MDA-MB-231細胞24 h的IC50值為(44.25±1.65)μmol/L。MTT結果表明，在1.56～25.00 μmol/L濃度范圍內，鴉膽子苦素D均可濃度依賴性地抑制MDA-MB-231細胞的增殖活性(P<0.01)(見表1)。

表1 各組細胞活力的比較

q檢驗：與對照組比較*P<0.05；與3.13 μmol/L組比較#P<0.05；與6.25 μmol/L組比較△P<0.05；與12.50 μmol/L組比較□P<0.05

2.2 鴉膽子苦素D對MDA-MB-231細胞中ATP含量的影響 與對照組相比，1、2、4 μmol/L鴉膽子苦素D均可降低MDA-MB-231細胞中ATP含量(P<0.05)(見表2)。

表2 各組細胞中ATP含量的比較

q檢驗：與對照組比較*P<0.05；與1 μmol/L鴉膽子苦素D組比較#P<0.05；與2 μmol/L鴉膽子苦素D組比較△P<0.05

2.3 不同濃度鴉膽子苦素D抑制MDA-MB-231細胞有氧糖酵解作用的比較 與對照組相比，1、2、4 μmol/L鴉膽子苦素D處理MDA-MB-231細胞的葡萄糖消耗量和乳酸生成量均減少(P<0.05)(見表3)。

表3 各組細胞中葡萄糖消耗量和乳酸生成量比較

q檢驗：與對照組比較*P<0.05；與1 μmol/L鴉膽子苦素D組比較#P<0.05；與2 μmol/L鴉膽子苦素D組比較△P<0.05

2.4 鴉膽子苦素D對糖酵解關鍵酶活性的抑制作用 與對照組相比，1、2、4 μmol/L鴉膽子苦素D均可降低MDA-MB-231細胞中HK、PFK、PK和LDH的活性(P<0.05)(見表4)。

2.5 鴉膽子苦素D對MDA-MB-231細胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白的抑制作用 與對照組相比，2、4 μmol/L鴉膽子苦素D處理MDA-MB-231細胞24 h，均可抑制細胞中PI3K、p-Akt蛋白的表達(P<0.05)(見圖1、表5)。

表4 各組細胞中HK、PFK、PK、LDH活性比較

q檢驗：與對照組比較*P<0.05；與1 μmol/L鴉膽子苦素D組比較#P<0.05；與2 μmol/L鴉膽子苦素D組比較△P<0.05

3 討論

盡管多種治療方法被應用于TNBC，但是TNBC依然缺乏特定的靶向治療，預后較差。之前的研究[7]表明，乳腺癌的能量代謝過程可能作為潛在的靶向治療目標。本研究初步探討了鴉膽子苦素D對于TNBC細胞能量代謝的影響，并證實鴉膽子苦素D能明顯抑制MDA-MB-231細胞的有氧糖酵解過程。

Warburg效應指出，腫瘤細胞傾向于利用有氧糖酵解來產生能量，而不是通過氧化磷酸化作用。這種現象存在于包括乳腺癌在內的多種癌癥細胞內[8]。有氧糖酵解過程中1分子葡萄糖分解產生2分子ATP，而腫瘤細胞的生長和增殖需要ATP[9]。本研究結果表明，在鴉膽子苦素D處理后，MDA-MB-231細胞中ATP含量減少，可能出現供能不足。

有氧糖酵解是葡萄糖轉變?yōu)楸?，最終生成乳酸的過程[10]。葡萄糖作為有氧糖酵解底物，可以為機體提供能量，是細胞主要能量來源。乳酸是有氧糖酵解最終產物，同時在能量調節(jié)中發(fā)揮關鍵作用。用鴉膽子苦素D處理后，MDA-MB-231細胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量都明顯減少，提示MDA-MB-231細胞中有氧糖酵解過程被鴉膽子苦素D抑制。

分組nPI3KAktp-Akt對照組30.19±0.020.23±0.030.21±0.021μmol/L鴉膽子苦素D30.16±0.01?0.20±0.020.16±0.012μmol/L鴉膽子苦素D30.09±0.02?#0.20±0.010.07±0.02?#4μmol/L鴉膽子苦素D30.04±0.01?#△0.19±0.020.02±0.01?#△F—76.412.91132.12P—<0.01>0.05<0.01MS組內—0.0000.0000.000

q檢驗：與對照組比較*P<0.05；與1 μmol/L鴉膽子苦素D組比較#P<0.05；與2 μmol/L鴉膽子苦素D組比較△P<0.05

有氧糖酵解過程通過HK、PFK、PK、LDH 4種關鍵酶進行調節(jié)，它們在調節(jié)過程中發(fā)揮不同的作用[11]。糖酵解的第一步是將葡萄糖轉化為6-磷酸葡萄糖，HK在其中起關鍵作用[12]。PFK催化糖酵解的另一個限速步驟，即6-磷酸葡萄糖轉變?yōu)?,6-二磷酸果糖[13]。PK催化磷酸烯醇丙酮酸轉化為丙酮酸，并在此過程中生成ATP[14]。LDH催化糖酵解途徑中的最后一步，將丙酮酸轉化為乳酸。在用鴉膽子苦素D處理后，MDA-MB-231細胞中的HK、PFK、PK、LDH活性均明顯降低。

PI3K/Akt信號途徑參與多種生物學過程，包括葡萄糖代謝、細胞周期、細胞凋亡和血管生成，在腫瘤的生長和增殖中起著重要的作用[15]。Akt被認為是Warburg激酶，被激活后發(fā)生磷酸化轉變?yōu)閜-Akt，通過刺激HK和PFK促進葡萄糖代謝。PI3K是一種脂質激酶，可以增強HK和PFK活性從而增加糖酵解通量[16]。研究[17]表明，PI3K/Akt信號通路還可以調節(jié)PK和LDH活性。本研究結果表明用鴉膽子苦素D處理后，MDA-MB-231細胞中的PI3K、p-Akt表達均降低，提示MDA-MB-231細胞中PI3K/Akt信號通路活性被鴉膽子苦素D所抑制。結合前面的實驗結果，提示鴉膽子苦素D可通過抑制PI3K/Akt信號通路，進而降低有氧糖酵解關鍵酶活性并抑制有氧糖酵解，減少MDA-MB-231細胞能量供應。

綜上所述，鴉膽子苦素D通過抑制MDA-MB-231細胞中PI3K/AKT信號通路,從而降低有氧糖酵解水平，減少細胞能量供應。本研究結果提示鴉膽子苦素D可能作為治療TNBC的潛在抗腫瘤藥物，為未來藥物開發(fā)提供理論基礎。