韓 莎，胡 煒，李成林**，曲洪霞，趙 斌，劉兆存

(1.山東省海洋生物研究院，山東青島 266104；2.乳山市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，山東乳山 264500；3.山東華春漁業(yè)有限公司 山東東營(yíng) 257200)

0 引言

刺參ApostichopusjaponicusSelenka極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健作用逐步得到世界的認(rèn)同，因此刺參也越來(lái)越受消費(fèi)者的喜愛(ài)。近年來(lái)，刺參增養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖方式多樣化，其中池塘養(yǎng)殖是目前我國(guó)刺參養(yǎng)殖的主要模式[1]。但是，池塘養(yǎng)殖易受水溫、鹽度等多種外界環(huán)境因素影響[2]，其中養(yǎng)殖水pH是關(guān)鍵因子之一[3-4]。與此同時(shí)，在池塘刺參養(yǎng)殖中還普遍存在底質(zhì)老化、池底糞便有害物質(zhì)大量積累與氨化分解等問(wèn)題；另外，養(yǎng)殖池塘易受近岸海水的影響，尤其是近年來(lái)近海滸苔等大型藻類連續(xù)暴發(fā)[5]、腐爛，加之時(shí)常受到集中強(qiáng)降雨、酸雨、海水酸化等影響，池塘養(yǎng)殖水pH呈現(xiàn)周期性或臨時(shí)性波動(dòng)，不同程度地影響著刺參攝食與生長(zhǎng)。目前，有關(guān)養(yǎng)殖水pH對(duì)刺參生理影響的研究資料較少[6-7]，多集中在慢性脅迫對(duì)刺參影響的實(shí)驗(yàn)研究，而pH節(jié)律性變動(dòng)對(duì)刺參生長(zhǎng)和消化的影響相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)基于不同pH處理時(shí)間下刺參生長(zhǎng)、攝食與消化酶活性的變化，以探明pH節(jié)律性變動(dòng)與刺參生長(zhǎng)、消化的關(guān)系，為刺參健康養(yǎng)殖和養(yǎng)殖水環(huán)境的調(diào)控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用刺參為青島國(guó)家海洋科研中心山東省海洋生物研究院鰲山基地選育的健康苗種，選取體表正常、活力強(qiáng)、攝食良好的苗種暫養(yǎng)在0.2 m3的玻璃鋼槽中，平均體重為(20.32±0.15) g。養(yǎng)殖海水為經(jīng)沉淀沙濾的自然海水，鹽度(31.4±0.2)‰，水溫14.6-17.3℃，溶解氧DO≥5.6 mg/L，24 h連續(xù)微量充氣，每天全量換水1次。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)刺參飼養(yǎng)在25 L的塑料整理箱中，每個(gè)箱中放置刺參10頭，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組各設(shè)3個(gè)平行。以自然海水(pH=8.1±0.3)為對(duì)照，根據(jù)韓莎等[7]研究，實(shí)驗(yàn)設(shè)定pH 7.3(A)、pH 8.9(B)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，在這兩組pH條件下進(jìn)行5種處理，每日早上8:00通過(guò)換水調(diào)節(jié)在該pH條件下分別處理1 h (A1、B1)、3 h (A2、B2)、6 h (A3、B3)、9 h (A4、B4)、12 h(A5、B5)，再次換水使pH恢復(fù)正常，每天為1個(gè)實(shí)驗(yàn)周期。每日16:00投喂飼料l次，共持續(xù)30 d。各實(shí)驗(yàn)組使用1 mol/L的鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水pH，在換水前調(diào)節(jié)校正至實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所需pH且穩(wěn)定后方可用于實(shí)驗(yàn)。采用哈納HI98185多參數(shù)水質(zhì)分析儀測(cè)定并及時(shí)校正水中pH，變化幅度為±0.05個(gè)單位。

1.2.2 刺參生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1 d停止投喂，稱量刺參初始體重W0(g)，實(shí)驗(yàn)30 d結(jié)束前同樣停止投喂1 d后稱其體重最終值Wt(g)。稱重時(shí)，先將刺參取出，吸干體表水分后稱量。t為實(shí)驗(yàn)持續(xù)的時(shí)間(d)。觀測(cè)并記錄刺參吐臟、存活情況。N0為刺參實(shí)驗(yàn)個(gè)體數(shù)，Nt為刺參存活個(gè)體數(shù)，Ne為刺參排臟個(gè)體數(shù)，F(xiàn)為飼料總攝入量(g)。各項(xiàng)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)、計(jì)算方法采用以下公式：

特定生長(zhǎng)率(Specific Growth Rate，SGR，%)=(lnWt-lnW0)/t×100；

攝食率(Feeding Rate，F(xiàn)R，%)=2F/[t(Wt+W0)]×100;

食物轉(zhuǎn)化率(Food Conversion Ratio，F(xiàn)CR，%)=(Wt-W0)/F×100

1.2.3 刺參消化酶測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將刺參撈出待其排凈體內(nèi)海水，用滅菌紗布擦干體表水分放入玻璃培養(yǎng)皿中，沿腹部剪開(kāi)，取出消化道，剔除呼吸樹(shù)，用超純水沖洗干凈，在-80℃超低溫冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)取腸組織置于玻璃勻漿器中，加入10倍體積預(yù)冷的超純水，在冰浴條件下勻漿20 min，在高速冷凍離心機(jī)中(0-4℃，1 000 r/min)離心30 min，所得上清液置于冰箱保存待測(cè)。

消化酶指標(biāo)——蛋白酶和淀粉酶均采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測(cè)定。蛋白酶活力測(cè)定采用鉬酸銨法，每毫克組織蛋白在37℃條件下每分鐘分解蛋白生成1 μg氨基酸相當(dāng)于1個(gè)酶活力單位(U)。淀粉酶(AMS)含量測(cè)定采用比濁法，組織中每毫克蛋白在37℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)淀粉酶活力單位(U)。酶液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定按南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒上的說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示，用SPSS 18.0及Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)，以P<0.05作為顯著性差異的標(biāo)志。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH處理時(shí)間對(duì)刺參生長(zhǎng)和攝食的影響

如表1所示，A組刺參終末體重和SGR隨pH處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在pH處理時(shí)間為6 h時(shí)，終末體重為 26.45 g，SGR為0.88%/d，除A2和A3組顯著高于對(duì)照組外(P<0.05)，其余各組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)；當(dāng)pH處理時(shí)間超過(guò)6 h時(shí)，刺參終末體重和SGR逐漸下降且低于對(duì)照組，但差異不顯著。B組刺參終末體重和SGR隨pH處理時(shí)間的增加而逐漸下降，當(dāng)pH處理時(shí)間超過(guò)3 h時(shí)，刺參終末體重和SGR顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，B5組刺參終末體重和SGR最低，分別為22.87 g、0.39%/d。

A組刺參FR、FCR隨pH處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，除A2和A3組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其余各組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，其中以A3組最高，F(xiàn)R為2.19%，F(xiàn)CR為39.85%，當(dāng)pH處理時(shí)間超過(guò)6 h時(shí)，刺參個(gè)體FR、FCR低于對(duì)照組，但差異不顯著；B組刺參FR、FCR隨pH處理時(shí)間的增加而逐漸下降，當(dāng)pH處理時(shí)間超過(guò)3 h時(shí)，刺參FR和FCR逐漸下降且顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表1 不同pH處理時(shí)間對(duì)刺參生長(zhǎng)和攝食的影響

Table 1 Effects of different pH treatment time on the growth and feeding ofA.japonicusSelenka

組別Group處理時(shí)間Time (h)初始體重Initial body weight (g)終末體重Final body weight (g)特定生長(zhǎng)率Specific growth rate (%/d) 攝食率Feeding rate (%)食物轉(zhuǎn)化率Food conversion efficiency (%)對(duì)照CK020.32±0.15a24.56±0.17a0.63±0.06a1.75±0.06a36.08±0.20aA1120.32±0.15a25.32±0.13ab0.73±0.09ab1.89±0.11ab38.49±0.25abA2320.32±0.15a25.73±0.18b0.79±0.06b2.01±0.10b38.95±0.19bA3620.32±0.15a26.45±0.16b0.88±0.07b2.19±0.08b39.85±0.15bA4920.32±0.15a24.26±0.19a0.59±0.08a1.59±0.08a36.92±0.17aA51220.32±0.15a23.84±0.15a0.53±0.07a1.53±0.12a34.68±0.16aB1120.32±0.15a24.86±0.13a0.67±0.05a1.86±0.09a38.06±0.18aB2320.32±0.15a24.68±0.19a0.65±0.10a1.77±0.07a38.31±0.16aB3620.32±0.15a23.42±0.14c0.47±0.11c1.48±0.09c32.02±0.19cB4920.32±0.15a23.25±0.15c0.45±0.09c1.42±0.03c31.58±0.21cB51220.32±0.15a22.87±0.16c0.39±0.07c1.35±0.06c29.11±0.23c

注：同列中不同字母組間表示差異顯著(P<0.05)

Note:Values in the same column with different letter superscripts are significantly different (P<0.05)

2.2 pH處理時(shí)間對(duì)刺參消化酶活性的影響

2.2.1 pH處理時(shí)間對(duì)刺參蛋白酶活性的影響

由圖1可以看出，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，A組刺參蛋白酶活性隨著pH處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。當(dāng)pH處理時(shí)間在1-6 h時(shí)，A組刺參蛋白酶活性隨著pH處理時(shí)間的增加逐漸升高，在處理時(shí)間6 h時(shí)達(dá)到最高，為7.75 U/mg prot，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而其余各組與對(duì)照組差異不顯著。B組刺參蛋白酶活性隨著pH處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)逐漸低于對(duì)照組的變化規(guī)律，以pH處理時(shí)間12 h時(shí)最低，為5.36 U/mg prot，各處理組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

2.2.2 pH處理時(shí)間對(duì)刺參淀粉酶活性的影響

由圖2可以看出，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，A組刺參淀粉酶活性隨著pH處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。當(dāng)pH處理時(shí)間在1-6 h時(shí)，A組刺參淀粉酶活性隨著pH處理時(shí)間的增加逐漸升高，在處理時(shí)間6 h時(shí)達(dá)到最高，為1.48 U/mg prot，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而其余各組與對(duì)照組差異不顯著。B組刺參淀粉酶活性隨著pH處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)逐漸低于對(duì)照組的變化規(guī)律，以pH處理時(shí)間12 h時(shí)最低，為1.79 U/mg prot，各處理組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Different letters on the graph mean siginificant differences (P<0.05)

圖1 不同pH處理時(shí)間對(duì)刺參蛋白酶活性的影響

Fig.1 Effect of different pH treatment time on protease activity ofA.japonicusSelenka

圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Different letters on the graph mean siginificant differences (P<0.05)

圖2 不同pH處理時(shí)間對(duì)刺參淀粉酶活性的影響

Fig.2 Effect of different duration pH treatment time on amylase activity ofA.japonicusSelenka

3 討論

3.1 pH處理時(shí)間對(duì)刺參生長(zhǎng)的影響

研究表明，環(huán)境因子在適宜范圍內(nèi)變動(dòng)，對(duì)水生生物的生長(zhǎng)影響不大，但如果超過(guò)適宜范圍，就會(huì)產(chǎn)生抑制作用[8-9]。通常情況下，自然海水pH為7.8-8.5，水質(zhì)的變化時(shí)常會(huì)導(dǎo)致水體pH在4-10內(nèi)波動(dòng)變化[6]。韓莎等[7]研究認(rèn)為通常情況下，當(dāng)養(yǎng)殖水pH為7.5-8.7時(shí),刺參均可正常活動(dòng)、攝食與生長(zhǎng)，未表現(xiàn)出異常狀況。而本實(shí)驗(yàn)選擇的兩個(gè)pH梯度均超出該范圍，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在養(yǎng)殖水pH為7.3時(shí)，隨著pH處理時(shí)間的增加，刺參SGR和攝食率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)；但相對(duì)于酸性方向的變化來(lái)說(shuō)，堿性方向變化對(duì)刺參的抑制作用或產(chǎn)生的不利影響更為明顯。pH變化對(duì)刺參來(lái)說(shuō)是一種應(yīng)激，筆者認(rèn)為應(yīng)激的效果取決于應(yīng)激的程度和時(shí)間，而不是單純產(chǎn)生不利的影響[10]。本實(shí)驗(yàn)中pH向酸性或者堿性方向的變化屬于小幅度應(yīng)激，每天不超過(guò)6 h的刺激，對(duì)刺參的應(yīng)激刺激尚處于喚醒階段隨即恢復(fù)正常，因此對(duì)刺參的攝食和生長(zhǎng)有一定的積極作用，這一點(diǎn)與鄭振華等[11]對(duì)凡納濱對(duì)蝦的研究結(jié)果一致。而當(dāng)每日超過(guò)6 h的pH處理會(huì)使刺參進(jìn)入持續(xù)的應(yīng)激狀態(tài)，在抵御刺激中消耗大量的能量，因此用于生長(zhǎng)的能量大幅度減少。隨著應(yīng)激時(shí)間的增加，刺參機(jī)體的代謝發(fā)生紊亂，SGR下降，從而影響刺參的攝食與生長(zhǎng)。

3.2 pH處理時(shí)間對(duì)刺參消化酶活性的影響

水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育離不開(kāi)對(duì)食物的消化吸收，而該過(guò)程的實(shí)現(xiàn)需要多種酶，尤其是消化酶。因此，消化酶活性的研究一直是水產(chǎn)動(dòng)物消化生理的重要研究?jī)?nèi)容[12]，眾多學(xué)者對(duì)消化酶的影響因素相繼開(kāi)展大量的實(shí)驗(yàn)研究工作[13-15]，認(rèn)為溫度和pH是影響消化酶活力的最重要因素[16]。刺參作為棘皮動(dòng)物，其體腔內(nèi)環(huán)境與水環(huán)境密切相關(guān)，水體pH的變化與刺參腸道消化酶活性密切相關(guān)，且直接影響著刺參消化酶活性的高低。

蛋白酶和淀粉酶是刺參腸道的主要消化酶。刺參能夠攝取沉積食物中的營(yíng)養(yǎng)成分并合成自身的蛋白質(zhì)，主要靠蛋白酶發(fā)揮作用，其酶活力最高，其次是淀粉酶[17]。消化酶必須在一定的pH條件下才能表現(xiàn)出高活力[18]，消化酶活力的高低是刺參消化吸收能力的決定性因素[19]。付雪艷[20]認(rèn)為刺參蛋白酶活性最高時(shí)的水環(huán)境pH為7.0-9.0，而姜令緒等[19]認(rèn)為刺參中腸蛋白酶在pH為7.0-8.6時(shí)、淀粉酶在pH為6.6-7.4時(shí)其對(duì)應(yīng)的酶活性較高且相對(duì)穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在養(yǎng)殖水pH=7.3時(shí)，隨著pH處理時(shí)間的增加消化酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的變化，當(dāng)處理時(shí)間為6 h時(shí)，刺參蛋白酶和淀粉酶活力最高；而在養(yǎng)殖水pH=8.9時(shí)，蛋白酶和淀粉酶活性隨著pH處理時(shí)間的增加逐漸下降，該結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)水體pH在未超出蛋白酶和淀粉酶最適pH范圍時(shí)，消化酶活性的高低與pH處理時(shí)間關(guān)系密切。短時(shí)間的pH變動(dòng)尚屬在刺參正常調(diào)節(jié)范圍內(nèi)，機(jī)體能夠創(chuàng)造出適合消化酶發(fā)揮活性的pH環(huán)境，有利于蛋白質(zhì)和淀粉的消化，因此在一定程度上提高食物轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)生長(zhǎng)；而如果長(zhǎng)時(shí)間處于pH變動(dòng)的水環(huán)境中，刺參對(duì)飼料的攝食和消化利用受到影響，進(jìn)而不同程度地降低刺參的食物轉(zhuǎn)化率，導(dǎo)致生長(zhǎng)減緩。

4 結(jié)論

水生生物生活在一個(gè)節(jié)律變動(dòng)的環(huán)境下。pH作為應(yīng)激因子，對(duì)同一pH處理也會(huì)隨著不同處理時(shí)間的變化發(fā)生性質(zhì)上的改變，對(duì)水生生物產(chǎn)生有益或有害的作用效果。因此，在刺參養(yǎng)殖中，應(yīng)充分考慮養(yǎng)殖水體的pH變化幅度或者變化時(shí)間，盡量減少或者減緩pH變化的幅度和時(shí)間，從而減輕對(duì)刺參的應(yīng)激反應(yīng)，以保證刺參的充分?jǐn)z食和快速生長(zhǎng)，提高養(yǎng)殖效率。