蘇 坤，黃 英，李良波，利達朝，唐 輝，黃榮韶,**

(1.廣西大學農(nóng)學院，廣西南寧 530004；2.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西南寧 530200；3.廣西廣澤健康產(chǎn)業(yè)股份有限公司，廣西南寧 530205；4.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所，廣西桂林 541000)

0 引言

植物內(nèi)生菌一般指那些在其生活史的一定階段或全部階段存活于健康植物各種組織內(nèi)，不會對宿主植物產(chǎn)生明顯病害的微生物[1]。經(jīng)過長期的共同進化，植物內(nèi)生菌與宿主植物已經(jīng)建立了一種穩(wěn)定的互利共生關(guān)系，可以在植物體內(nèi)獨立繁殖[2]。許多研究表明，植物內(nèi)生菌可以通過溶磷、合成植物激素、固氮、合成鐵載體等方式產(chǎn)生各種生理活性物質(zhì)，直接或間接地促進植物生長，為宿主植物提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)，也可以通過誘導植物防御機制，提高宿主植物對干旱、重金屬、高鹽堿、病害等物脅迫的抗逆性。

牛大力是豆科雞血藤屬植物美麗雞血藤Calleryaspeciosa，主產(chǎn)于長江流域以南各地，是嶺南地區(qū)著名的藥食兩用中藥材。牛大力味甘、性平[3]，可潤肺補虛、強筋活絡(luò)，在臨床上常用于治療跌打損傷、腰肌勞損、肺虛咳嗽、慢性肝炎、遺精、白帶等癥[4]。近年來，廣東、廣西、香港、澳門等地民間普遍使用牛大力熬制靚湯藥食兩用，需求有逐年增長之勢[5]。由于目前市場需求與日俱增，牛大力野生資源被過度采挖，原材料極度短缺，生態(tài)環(huán)境也被嚴重破壞[6]。內(nèi)生菌是一類具有極大潛力的微生物資源，具備促進植物生長及對環(huán)境友好等特性，還能產(chǎn)生與宿主植物相同或類似藥用價值的活性成分，這可緩解因市場需求造成的野生資源被過度采挖的壓力，為保護瀕危野生藥用植物帶來新思路。目前，學者主要針對牛大力的化學成分、藥理作用以及組織培養(yǎng)等研究進行了大量的工作，而牛大力內(nèi)生菌的研究鮮有報道。本研究對采自廣西天等縣、資源縣、南丹縣以及那坡縣4地的野生牛大力進行內(nèi)生細菌的分離，研究其促生特性，旨在為開發(fā)利用牛大力有益內(nèi)生菌株資源提供基礎(chǔ)理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

野生牛大力植株采自廣西天等縣、資源縣、南丹縣以及那坡縣，將生長狀況良好的健康植株用塑封袋帶回實驗室,置4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?4 h內(nèi)進行內(nèi)生細菌的分離。采集的植物樣品經(jīng)廣西大學農(nóng)學院黃榮韶教授鑒定，為豆科雞血藤屬植物美麗雞血藤Calleryaspeciosa。

1.2 供試培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基(1 L)：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂18 g，pH值為7.0—7.2；用于分離、培養(yǎng)細菌。

營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基(1 L)：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH值為7.0—7.2；用于培養(yǎng)細菌。

阿須貝氏(Ashby)培養(yǎng)基(1 L)：CaCO35 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，甘露醇10 g，瓊脂13 g，pH值為7.0-7.2；用于固氮菌培養(yǎng)。

IAA 檢測培養(yǎng)基(1 L)：L-色氨酸0.5 g，酪蛋白氨基酸0.5 g，酵母浸粉0.5 g，無水葡萄糖0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，胰蛋白胨0.5 g，丙酮酸鈉0.3 g，K2HPO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g， pH值為7.0—7.2；用于產(chǎn)IAA能力的定性與定量測定。

CAS檢測培養(yǎng)基(1 L)：CAS染液50 mL，10%酪蛋白氨基酸30 mL，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液5 mL， 20%蔗糖溶液10 mL，1 mmol/L CaCl21 mL，瓊脂18 g；用于產(chǎn)鐵載體能力的定性檢測。

MKB培養(yǎng)基(1 L)：K2HPO42.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，甘油15 mL，酪蛋白氨基酸5.0 g，pH值為7.2；用于產(chǎn)鐵載體能力的定量測定。

NBRIP培養(yǎng)基(1 L)：KCl 0.2 g，MgCl2·6H2O 0.3 g，Ca3(PO4)25 g， MgSO4·7H2O 0.25 g，葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.1 g，瓊脂13 g，pH值為7.0—7.2；用于溶磷能力的定性與定量測定。

1.3 方法

1.3.1 牛大力內(nèi)生細菌的分離、純化

采用組織塊分離法進行牛大力內(nèi)生細菌分離。取野生牛大力植株的根、莖組織用流水洗凈表面的泥土等雜物，用濾紙吸干表面水分，隨后將植物組織切塊，用無菌水沖洗3次備用。牛大力組織消毒方法：分別用75%乙醇和1%次氯酸鈉表面消毒浸泡4—5 min，多次搖晃瓶身使組織塊與消毒液充分接觸，無菌水沖洗4次以洗凈殘余的消毒液；最后用無菌濾紙吸去表面水分。取最后沖洗液涂布于NA培養(yǎng)基平板，28℃倒置培養(yǎng)3 d，若無菌落出現(xiàn)，則表明植物組織表面消毒徹底。將消毒合格的根、莖組織分別用無菌刀片切去表皮及邊緣部分，剪碎后轉(zhuǎn)移至無菌研缽中研磨成勻漿，將研磨液適當進行梯度稀釋，各取100 μL至NA培養(yǎng)平板上，均勻涂布，28℃下黑暗培養(yǎng)2—3 d。挑選菌落形態(tài)不同的單菌落純化3次，將菌落表面形態(tài)特征及鏡檢形態(tài)都相同的菌落合并為同一類。將純化的菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 內(nèi)生細菌的分子生物學鑒定

參考Terefework等[7]的方法采用改良的CTAB法提取所有菌株的DNA，選用細菌16S rDNA通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行基因擴增。30 μL PCR反應體系包括Premix Taq 15 μL，Template DNA 1.2 μL，上下游引物各0.6 μL，ddH2O 12.6 μL；PCR反應條件：94℃、3 min，94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，30個循環(huán)后，再72℃、10 min。產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，擴增序列條帶在1 500 pb左右，PCR擴增產(chǎn)物序列測定委托上海生工生物工程有限公司完成。測序結(jié)果提交NCBI進行在線同源比對，根據(jù)相似性下載相關(guān)菌株序列，用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 內(nèi)生細菌的促生特性

固氮能力檢測：參照李驁[8]的方法將活化的待測菌株接種于Ashby液體培養(yǎng)基中， 28℃、180 r/min 搖床恒溫震蕩培養(yǎng)，每個處理重復3次。分別在第3 d和第7 d目測對比處理組與對照組的渾濁度，若明顯渾濁即為陽性；將陽性菌株活化并接種到Ashby平板上，28℃黑暗培養(yǎng)，連續(xù)繼代培養(yǎng)3次，若菌株能正常生長，即為有固氮活性。

溶磷能力測定：參照鐘傳青等[9]的方法，將各菌株接種于NBRIP培養(yǎng)基平板上，28℃暗培養(yǎng)6 d后，觀察菌落周圍有無透明圈出現(xiàn)。若有透明圈出現(xiàn)說明細菌能解磷。將初篩的具有溶磷性菌株在NB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，按1%的接種量接種于NBRIP液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)6 d后，用鉬銻抗比色法，根據(jù)標準曲線計算上清液有效磷含量。

產(chǎn)鐵載體能力測定：參照Schwyn和Neilands[10]的CAS平板法，將活化后的待測菌株點接于CAS藍色固體平板上， 28℃黑暗培養(yǎng)5 d，觀察檢測培養(yǎng)基的顏色變化，若菌落周圍有橙黃色暈圈產(chǎn)生則為陽性。將陽性菌株活化接種于MKB培養(yǎng)基中， 在28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)液離心后取2 mL上清液與等體積CAS檢測液充分混合，反應60 min后，觀察顏色變化，根據(jù)公式計算各菌株分泌鐵載體活性。

產(chǎn)IAA能力測定：參照Sarwar和Kremer[11]的比色法，將待測菌株接種于添加有L-色氨酸(0.5 g/L)的IAA檢測培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)2 d；菌液8 000 r/min離心10 min后取500 μL上清液，與Sackowki顯色劑1∶1混合，室溫避光放置30 min后觀察顏色變化，若混合液出現(xiàn)紅色或粉紅色，則表示菌株具有合成IAA能力，根據(jù)標準曲線計算菌液中IAA的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細菌分離純化

通過平板劃線、革蘭氏染色、菌落形態(tài)觀察等手段，從廣西4地采集到的野生牛大力根、莖兩部分組織中一共分離到可培養(yǎng)內(nèi)生細菌59株，其中從根中分離得到48株(占總分離菌株的81.36%)，莖中分得11株(占總分離菌株的18.64%)。通過單菌落形態(tài)、顏色、大小、濕度等菌落特征及顯微鏡鏡檢特征，將59株內(nèi)生細菌進行同類合并，初步鑒定為34組。

2.2 內(nèi)生細菌的16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

對34組內(nèi)生細菌的16S rDNA基因片段進全序列測定，測定結(jié)果提交NCBI與已知序列進行同源性比對，Blast分析結(jié)果如表1所示。對內(nèi)生菌和相似性最高的相關(guān)模式菌株的16S rDNA基因序列分析，利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。由結(jié)果可知，34組內(nèi)生細菌分屬于4門16屬20種。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，牛大力內(nèi)生細菌主要有Bacillus、Kosakonia、Myroide、Leclercia、Providencia、Pantoea、Proteus等。其中芽孢桿菌屬Bacillus數(shù)量最多，有12株，占總分離菌株的20.34%，為優(yōu)勢菌屬。根據(jù)優(yōu)勢菌種的分類原則，牛大力的優(yōu)勢菌種有Kosakoniapseudosacchari(11.86%)、Myroidesodoratimimus(11.86%)以及Leclerciasp.(10.17%)。

表1 牛大力內(nèi)生細菌分布及相對頻率

Table 1 Distribution and relative frequency of endophytic bacteria inMillettiaspeciosa

菌株編號No.of strains 相似性最高的菌株The most similar model strain相似性Similarity (%)分離數(shù)量Quantity of separation相對頻率Relative frequency (%)ST15Proteus mirabilis (KC456539)9846.78RT71Alcaligenes faecalis subsp.(KC790302)9923.38RH171Burkholderia sp.(KF788025)9911.69RH172Rhizobium sp.(JQ697681) 9911.69RH175Leclercia sp.(KP265974)99610.17GR11Pseudomonas koreensis (KF424274)9811.69GR21Pantoea dispersa (GQ200831)9811.69GR41Providencia vermicola (KX098543)9858.47XDR01Stenotrophomonas maltophilia (KY078806)9823.38XDR12Acinetobacter johnsonii (KY767512)9811.69XDR34Bacillus sp.(KC857472)9835.08DR13Bacillus oryzaecorticis (KU877673)9735.08DR51Bacillus safensis (KR708899)9935.08TBR0Micrococcus luteus (KT003279)9923.38TBR7Pantoea sp.(KR029327)9835.08TBR10Kosakonia pseudosacchari (NR135211)99711.86NR53Paenibacillus castaneae (NR044403)9935.08NR72Bacillus sp.(KP126830)9835.08RH14Brevibacillus sp.(GU471747)9911.69SH26Myroides odoratimimus (JF775418)99711.86

圖1 內(nèi)生細菌16S rDNA系統(tǒng)進化樹

2.3 牛大力內(nèi)生細菌促生特性分析

2.3.1 不同菌株的固氮能力

本試驗分析了20株代表性牛大力內(nèi)生細菌的促生特性，促生結(jié)果見表2。根據(jù)20株內(nèi)生細菌在Ashby培養(yǎng)基上的生長結(jié)果顯示，共11株菌繼代3次仍能在Ashby培養(yǎng)基正常生長，說明這些牛大力內(nèi)生細菌具有潛在的固氮潛力，占測定菌株總數(shù)的35%。

表2 牛大力內(nèi)生細菌促生特性

Table 2 Activity of endogenous bacteria to promote the life

菌株編號No.of strains固氮Nitrogenfixing溶磷Soluble phoaphate(mg/L)產(chǎn)鐵載體Siderophore detection(%)產(chǎn)IAA IAA production(mg/L)RH172+9.1049.766.17RT71----RH171+8.67--TBR10+1.60-12.68RH175+3.3365.291.75TBR7+17.44--GR21+2.4465.9712.68GR41+4.90-16.30ST15+3.84-29.48XDR12-4.2870.1943.10GR11-4.6261.12-XDR34+--20.40DR51-10.44--XDR01+---NR72+14.78-13.02DR13-9.5069.3921.48NR53-7.52-35.48RH14-7.94-1.11SH26-15.1273.12-TBR0-14.81-31.35

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性

Note："+" indicates positive result，"-" indicates negative result

2.3.2 不同菌株的溶磷能力

經(jīng)過溶解磷酸鈣能力的定性初篩，共有17株菌可以在NBRIP培養(yǎng)基上形成溶磷圈，占測定菌株總數(shù)的85%。通過定量測定，不同內(nèi)生細菌的難溶性磷酸鹽溶解量不同，有效磷增量為1.60—14.71 mg/L，菌株TBR7、RH1-4、TBR0及NR7-2的難溶性磷酸鹽溶解能力相對較強(表2)。

2.3.3 不同菌株的產(chǎn)鐵載體能力

通過CAS平板測定內(nèi)生細菌的產(chǎn)鐵載體能力，結(jié)果顯示(表2)，7株內(nèi)生細菌可以產(chǎn)鐵載體，占待測菌株總數(shù)的35%。定量結(jié)果表明，有6株內(nèi)生細菌為高產(chǎn)鐵載體菌株，產(chǎn)鐵載體活性均>50%，其中菌株XDR1-2 分泌鐵載體活性高達70.19%。

2.3.4 不同菌株的產(chǎn)IAA能力

通過顯色反應分析牛大力內(nèi)生細菌產(chǎn)IAA的能力，發(fā)現(xiàn)共有13株內(nèi)生細菌出現(xiàn)不同程度的顯色，占待測菌株總數(shù)的65%。通過定量測定，不同內(nèi)生細菌的IAA產(chǎn)生量存在明顯區(qū)別(1.11—43.10 mg/L)， 其中XDR1-2、NR5-3、TBR0、ST1-5菌株產(chǎn)IAA的能力相對較強(表2)。

3 討論

內(nèi)生細菌幾乎存在于所有已研究的植物中，具有豐富的物種多樣性。內(nèi)生細菌的16S rDNA序列含有的可變序列是每個微生物特有的特征序列，可以作為鑒定細菌種屬的分子基礎(chǔ)，廣泛應用于細菌的分類鑒定[12]。如朱艷蕾[13]從銀砂槐根、葉組織中分離出45株內(nèi)生細菌，經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定為芽孢桿菌屬等13個屬; 張曉波等[14]從藥用植物駱駝刺中分離出的50株內(nèi)生菌經(jīng)16S rDNA序列分析屬于15個菌屬。本研究從健康野生牛大力植株根、莖中分離的59株可培養(yǎng)內(nèi)生細菌經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定為16屬20種，反映了牛大力內(nèi)生細菌的菌群較為豐富。牛大力的優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬，這與前文及已報道的許多論文結(jié)果一致[13-16]。在牛大力不同部位分布的內(nèi)生細菌種類和數(shù)量有較大差異，內(nèi)生細菌主要存在于根部，可能是因為根系營養(yǎng)物質(zhì)豐富，有利于內(nèi)生細菌的生長繁殖。

內(nèi)生細菌生存于植物組織里，在植物組織中占據(jù)有利的生態(tài)位，在受到植物保護的同時，也比外界環(huán)境微生物更易于發(fā)揮其生物學功能[17]。植物內(nèi)生菌可通過多種途徑產(chǎn)生促進作用，如促進宿主植物生長、拮抗病原菌以及提高宿主植物抗逆能力等[18-20]。本研究分離的牛大力內(nèi)生細菌具有溶磷、固氮、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體等多種促生功能，在實際的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有一定的應用潛力。

4 結(jié)論

本試驗從野生牛大力植株根莖組織中分離得到59株內(nèi)生細菌，通過對內(nèi)生細菌的16S rDNA基因進行序列分析，鑒定為16屬20種，說明牛大力內(nèi)生細菌具有豐富的物種多樣性。對鑒定的內(nèi)生細菌進行促生活性評估，結(jié)果表明有11株具有潛在的固氮能力，17株具有溶磷能力，7株具有產(chǎn)鐵載體的能力，有13株具有產(chǎn)IAA的能力。菌株RH17-2、RH17-5、GR2-1兼具固氮、溶磷性、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA能力。這些菌具有作為促生菌應用于促進植物生長等方面的潛力。