刁 菁，王友紅，王淑嫻，于曉清，許 拉，王曉璐，李 樂，蓋春蕾，葉海斌，樊 英

(山東省海洋生物研究院，山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，山東青島 266104)

0 引言

隨著我國海水魚工業(yè)化養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，集約化的生產方式和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，導致魚類病害種類增多、暴發(fā)頻率升高、危害程度加重，成為制約我國魚類養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一[1]。應用抗生素、消毒劑等化學藥物是水產養(yǎng)殖過程中病害防控的重要手段，但是其弊端也日益顯現：化學藥物的大量使用不僅會造成水產品藥物殘留，還能誘導病原微生物產生耐藥性、造成水體污染等[2]。由于魚類發(fā)病原因復雜，病原混合感染情況日益嚴重，特別是病毒性疾病暴發(fā)比例升高，傳統(tǒng)的化學藥物已不能起到有效的防治作用，魚病防治難度不斷加大[3]。為保證魚類養(yǎng)殖業(yè)穩(wěn)定可持續(xù)發(fā)展，滿足消費者對綠色水產品的需求，保障養(yǎng)殖環(huán)境的清潔，研篩綠色安全高效的魚病防控藥物十分緊迫。中草藥是自然界中可被人類直接藥用的植物、動物以及礦物等的統(tǒng)稱，在中醫(yī)醫(yī)療中的應用具有悠久的歷史，其天然高效、無殘留、無毒副作用、無耐藥性等特點引起人們的廣泛關注[4-5]。近年來，中草藥作為飼料添加劑在水產養(yǎng)殖動物疾病防治中的應用日益廣泛，不僅顯示出良好的抗菌、抗病毒和殺蟲特性，還具有提高機體免疫力、促生長、抗應激、提高繁殖力等多種功效[6-9]。Wu等[10]研究發(fā)現苦參Sophoraflavescens醇提取物能提高尼羅羅非魚Oreochromisniloticus血清中溶菌酶活性，促進其非特異性免疫反應，顯著增強其對鏈球菌的抗病能力；Haetrakul等[11]發(fā)現在鯉魚Cyprinuscarpio感染鯉皰疹病毒3型(CyHV-3)前后注射鱷嘴花Clinacanthusnutans葉片醇提取物具有顯著的抗病毒作用；張耀武等[12]將黃芪、茯苓、金銀花等組成的中草藥復方經水煎及超微粉碎后添加在飼料中連續(xù)投喂60 d，結果發(fā)現添加0.5%的復方中草藥制劑對黃顙魚的生長、血細胞的吞噬活性、溶菌酶活力影響顯著。牙鲆Paralichthysolivaceus是我國北方海水養(yǎng)殖經濟魚類的重要代表種。牙鲆養(yǎng)殖過程中的疾病種類多，在苗種培育及養(yǎng)成期均有發(fā)生，使牙鲆養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大經濟損失[13]。本研究基于中草藥藥物功效與配伍原則，研制出一種中草藥復方免疫增強劑，通過投喂試驗研究其對牙鲆抗細菌感染的效果，同時從免疫酶活及免疫基因水平分析復方中草藥免疫增強劑對牙鲆免疫力的影響。研究結果將為海水魚中草藥防病技術研究提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及試驗動物

致病性遲鈍愛德華氏菌Edwardsiellatarda由山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室從患病牙鲆中分離保存；健康牙鲆購自日照某養(yǎng)殖場，體長約(13±1) cm，體重(30±5) g。

1.1.2 試劑和耗材

中草藥復方(YLK)由山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室根據中草藥的藥物功效和配伍原則研發(fā)，配方主要包括黃芪、茯苓、黨參、蒲公英、魚腥草、白花蛇舌草、金銀花、玉竹、甘草、五味子等，中草藥微粉由山東亞康藥業(yè)股份有限公司加工制備，粉碎粒度為80%，通過200目篩；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒均購于TaKaRa公司；胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)購自北京陸橋技術有限責任公司；免疫相關酶活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；其他試劑購自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 中草藥投喂試驗

選取240尾健康牙鲆，隨機分成3組，每組80尾，分別飼養(yǎng)于3 m3水槽內，連續(xù)充氧，每天換水1次，養(yǎng)殖水溫(21±1)℃，暫養(yǎng)15 d后開始投喂試驗，投喂配合顆粒飼料。其中，實驗組1和實驗組2拌飼投喂中草藥復方YLK微粉，按每公斤配合顆粒飼料分別添加10 g和30 g配置成1%(W∶W)和3%(W∶W)的中草藥飼料，對照組僅投喂配合顆粒飼料，每日早晚各投喂1次，投餌量為魚體重的4%，連續(xù)投喂30 d。

1.2.2 攻毒和取樣

將遲鈍愛德華氏菌接種于TSB中，28℃培養(yǎng)12 h后，6 000 r/min離心10 min收集沉淀，用0.9%無菌生理鹽水洗2遍，將細菌重懸并調整濃度為5×107CFU/mL (10倍菌株半致死濃度)，對投喂后31 d的各實驗組進行攻毒處理，每尾魚經腹腔注射0.1 mL菌懸液。攻毒后各實驗組魚分別平均分為兩組，每組40尾，其中一組用于觀察魚體死亡情況，另外一組用于組織取樣。取樣組在攻毒前及攻毒后6，12，24，48，72 h分別取魚體的脾臟，在攻毒前及攻毒后24 h和72 h取魚血清，每個時間點每組取3尾魚。血清的取樣方式為尾靜脈取血，室溫放置2 h后，轉入4℃過夜，次日于4℃下3 000 g離心15 min，取上清-20℃保存；將魚體解剖后用無菌剪刀剪下脾臟并切成0.5 cm小塊置于RNAlater中保存；血清和脾臟分別用于免疫相關酶活性及免疫相關基因表達水平的檢測。攻毒后連續(xù)14 d觀察記錄魚體的累計死亡情況，并計算中草藥飼料投喂組的相對保護率，相對保護率(%)=(1-實驗組死亡率/對照組死亡率)×100%。

1.2.3 免疫相關酶活性的測定

利用酶活檢測試劑盒檢測魚體血清中4種非特異性酶活活性，包括血清中堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase，ACP)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)以及溶菌酶(Lysozyme，LSZ)活性檢測，檢測流程參照南京建成試劑盒說明書進行。

1.2.4 免疫相關基因表達水平測定

采用熒光定量PCR檢測免疫相關基因的應答變化。具體方法如下：以RNA提取試劑盒提取不同攻毒組各時間點牙鲆脾臟組織的總RNA，以High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit反轉錄合成cDNA第一鏈。設計特異性擴增牙鲆白介素1β (IL-1β)、白介素6 (IL-6)、TCRα受體及C型溶菌酶的引物(表1)，以延伸因子1α(EF-1α)作為內參基因，利用SYBR?Premix Ex TaqTM，在CFX96實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(Bio Rad，USA)中進行反應，所有反應均設置3個重復，熱循環(huán)條件如下：95℃預變性10 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)；應用CFX96 Manager軟件分析實驗數據。以各投喂組攻毒前樣品作為參照，計算各基因在免疫后不同時間點的相對表達量。

表1 本研究所使用的引物及其序列信息

Table 1 Sequences of primers used in this study

引物Primer序列信息 Sequence information (5'→ 3')EF1α FEF1α RCTCGGGCATAGACTCGTGGTCATGGTCGTGACCTTCGCTCIL1β FIL1β RCAGCACATCAGAGCAAGACAACATGGTAGCACCGGGCATTCTIL6 FIL6 RCAGCTGCTGCAAGACATGGAGATGTTGTGCGCCGTCATCTCRα FTCRα RGGTCTGATGCTTCACAGTGTGAGACCGCCGGATCTTTCTTCACtype lysome FCtype lysome RTGTCATTGTGGCGATCAAATGGCTCCGATCCCGTTTGG

1.3 數據分析

實驗所得數據結果以平均數±標準誤差(Mean±SDE)表示。數據的統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 投喂中草藥YLK對牙鲆血清中免疫相關酶活性的影響

酶活檢測結果顯示，在遲鈍愛德華氏菌攻毒后，各實驗組魚體血清中ACP、ALP、SOD和LSZ活性水平均表現出不同程度的升高趨勢(圖1)，攻毒后24 h酶活水平顯著高于攻毒前，其中3%中草藥添加組在感染后24 h和72 h,4種酶的活性水平均顯著高于對照組，而1%中草藥添加組除ALP活性以外，其他3種酶活水平也顯著高于對照組。另外，兩種不同比例中草藥添加組魚體血清中酶活整體上沒有顯著性差異，僅在感染后72 h 3%中草藥添加組的ALP活性顯著高于1%中草藥添加組。

2.2 投喂中草藥YLK對牙鲆脾臟中免疫相關基因表達水平的影響

熒光定量PCR檢測結果如圖2顯示，各投喂組牙鲆在遲鈍愛德華氏菌攻毒后，脾臟組織中4種免疫相關基因表達量整體上均出現不同程度的上調，而兩個不同比例中草藥添加組牙鲆在免疫后多個時間點的基因表達水平均高于單獨投喂飼料組的牙鲆。其中，投喂中草藥組能較強地誘導IL-1β基因的表達，在攻毒后48 h表達量達到最高值，且顯著高于對照組，然后逐漸下調；IL-6基因在攻毒后72 h內均呈現顯著的上調表達，其中對照組和1%中草藥添加組在攻毒后24 h達到最大值，3%中草藥添加組在攻毒后48 h達到最大值，然后出現緩慢下調；TCRα基因和C型溶菌酶基因在攻毒后72 h內均發(fā)生上調表達，分別在攻毒后48 h和24 h達到最高值，然后緩慢下降，且投喂中草藥組顯著高于單獨投喂飼料組。比較兩個中草藥添加組牙鲆脾臟組織中4種免疫相關基因表達量，3%中草藥添加組比1%中草藥添加組更能誘導更高水平的基因表達。

2.3 投喂中草藥YLK對牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌感染能力的影響

攻毒試驗發(fā)現，不同投喂組牙鲆在注射感染遲鈍愛德華氏菌后，均出現不同程度的死亡情況(圖3)，其中對照組在感染后12 d達到死亡高峰，累積死亡率為95%，3%中草藥添加組和1%中草藥添加組分別在感染后10 d和11 d達到死亡高峰，累積死亡率分別為62.5%和70%。通過公式計算，添加3%中草藥和1%中草藥對牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌感染的相對保護率分別為34.2%和26.3%。

不同字母標注代表組間存在顯著性差異(P<0.05)

Different letters indicates the significant difference between two groups (P<0.05)

圖1 中草藥YLK對血清中非特異免疫酶活性的影響

Fig.1 The effect of Chinese herbal formula YLK on non-specific enzyme activity in sera

圖2 中草藥YLK對脾臟中免疫相關基因表達水平的影響

圖3 不同投喂組在遲鈍愛德華氏菌攻毒后的累積死亡率

Fig.3 The cumulative mortality rates of Japanese flounders challenged withEdwardsiellatarda

3 討論

3.1 中草藥YLK對牙鲆血清非特異免疫功能的影響

魚類屬于較低等的脊椎動物，非特異性免疫是其抵抗疾病的重要屏障，當非特異免疫力降低時，魚類疾病發(fā)生概率大大增加。魚類血清中的溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)以及超氧化物歧化酶(SOD)等活性酶類，是其重要的體液免疫因子，也是反映魚類非特異免疫力的重要指標。LSZ廣泛存在于魚類黏液、組織器官分泌液、血清以及吞噬細胞溶酶體中，能水解細菌細胞壁中的肽聚糖導致細菌溶解，還具有激活補體作用，在抗感染免疫過程中具有重要的作用[14]；ALP和ACP是吞噬細胞溶酶體酶的重要組成部分，其水解作用可以將病原體破壞降解，在非特異細胞免疫中發(fā)揮作用[15]；SOD則是魚體抗自由基損傷的關鍵抗氧化酶，在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關重要的作用，能夠指示魚體的整體免疫功能[16]。已有研究表明，不同的中草藥配方拌飼投喂魚體均能不同程度地提高魚體的非特異性酶活水平。李霞等[17]投喂添加含黃芪、白術、防風、百部、仙鶴草、土茯苓等復方中草藥后，牙鲆Paralichthysolivaceus堿性磷酸酶活性和溶菌酶活性含量隨中草藥添加濃度和投喂時間的增加而增多；Wu 等[18]發(fā)現在飼料中添加車前草和魚腥草可有效提高軍曹魚Rachycentroncanadum超氧化物歧化酶活性、活性氧生成及溶菌酶活性等非特異性免疫指標。Chen 等[19]發(fā)現黃連素可使團頭魴Megalobramaamblycephala的酸性磷酸酶、溶菌酶活性和補體 C3含量等免疫指標明顯提高。白東清等[20]研究表明長期連續(xù)投喂適宜水平的黃芪多糖能有效地促進黃顙魚Pelteobagrusfulvidraco體內 SOD、LSZ活力。本研究也同樣發(fā)現，中草藥YLK投喂組牙鲆在人工感染遲鈍愛德華氏菌后血清中ACP、ALP、SOD和LSZ活性水平顯著高于對照組水平，表明本研究研制的中草藥配方YLK可顯著提升牙鲆的非特異免疫水平。然而不同中草藥添加組之間沒有顯著性差異，說明在飼料中添加1%中草藥即能較好地激活和提高魚體免疫酶及抗氧化酶活性，增強魚體非特異免疫功能。

3.2 中草藥YLK對牙鲆免疫相關基因表達水平的影響

病原在入侵魚體后會引起免疫相關基因的上調或下調表達，基因表達水平的高低能夠反映魚體的免疫應答水平，可作為疫苗及免疫增強劑效果評價的重要指標。例如，白細胞介素家族是由單核細胞、淋巴細胞及其他細胞所產生的一類非常重要的細胞因子，IL-1β 作為 IL 家族重要的一員，是最早表達的一類炎性細胞因子，它能誘導淋巴細胞的生長以及分泌一些細胞因子來增強免疫應答，起到抗細菌、病毒、腫瘤的作用;IL-6是一種功能廣泛的多效性細胞因子，可調節(jié)淋巴細胞的增殖與分化，具有調節(jié)免疫應答、急性期反應及造血功能，在機體的抗感染免疫反應中起重要作用[21-22]。T細胞受體(TCR)是T細胞的表面標志，作為T細胞識別和結合內/外源性抗原的表面分子，TCR在免疫應答和免疫調節(jié)中發(fā)揮著重要的作用[23]。我們在前期研究中發(fā)現脂多糖與β葡聚糖對遲鈍愛德華氏菌亞單位疫苗具有免疫促進效果，能夠顯著上調免疫后牙鲆脾臟組織中IL-1β、IL-6、TCRα及C型溶菌酶等6種免疫相關基因表達量[24]；石和榮等[25]在投喂的基礎飼料中添加由板藍根、黃芩、黃芪、忍冬藤、白芷和甘草組成的復合中草藥添加劑，可以提高虎龍雜交石斑魚腎臟和脾臟中白細胞介素 β(IL-1β)、干擾素 γ(IFN-γ)和熱休克蛋白 70(HSP70)免疫相關基因的表達量；高風英等[26]利用生物素標記基因檢測羅氏沼蝦溶菌酶基因表達產物含量，結果表明經弧菌感染后，溶菌酶基因多個靶器官的表達量均比未經感染弧菌的羅氏沼蝦高，說明病原菌感染可使體內溶菌酶基因轉錄量增加，溶菌酶基因在非特異性免疫中有著直接作用。本研究發(fā)現各投喂組牙鲆在遲鈍愛德華氏菌攻毒后，脾臟組織中4種免疫相關基因表達量整體上均出現不同程度的上調，而兩個中草藥投喂組牙鲆在免疫后多個時間點的基因表達水平均顯著高于單獨投喂飼料組的牙鲆，說明添加的中草藥制劑能顯著提升牙鲆的免疫應答水平，而其與魚體的抗病能力存在密切相關性。

3.3 中草藥YLK對牙鲆抗病原菌感染能力的提升

將不同功效的中草藥依據中醫(yī)理論配伍形成的中草藥復方制劑，可以通過協(xié)同作用表現出殺滅病原、增強機體免疫系統(tǒng)功能、抗炎和抗應激以及補充營養(yǎng)促進生長等多重功效，從而對水產養(yǎng)殖動物疾病的預防和治療發(fā)揮作用。李超等[27]研究發(fā)現在基礎飼料中添加由黃芪、黨參、板藍根、大黃等組成的中草藥復方制劑投喂草魚后，其吞噬細胞活力、血清溶菌活力、血清抗菌活力等均顯著升高，草魚對多子小瓜蟲及嗜水氣單胞菌的抗感染能力均得到提升；馬愛敏等[28]用分別含連翹、豬苓、黃芩、茯苓和黃連水提取物的配合餌料飼喂美國紅魚Sciaenopsocellatus，其結果表明投喂含有黃芩和茯苓的藥餌可使美國紅魚的體長增長率和相對增質量率顯著提高，美國紅魚血液白細胞的吞噬活性和血清溶菌酶活性顯著提高，利用哈維氏弧菌Vibrioharveyi人工感染美國紅魚后黃芩組的相對免疫保護率最高達88.9%。本研究基于藥物特性和中藥配伍法則，選取補益類中草藥黃芪、茯苓、黨參等及清熱解毒類中草藥蒲公英、魚腥草、白花蛇舌草、金銀花等，形成1種復方中草藥免疫增強劑YLK，研究發(fā)現通過拌飼投喂YLK，可顯著降低牙鲆感染遲鈍愛德華氏菌后的死亡率，顯示出良好的免疫保護效果，且隨著中草藥添加量的增加，免疫保護效果更優(yōu)。結合本研究對于牙鲆血清免疫相關酶活性及免疫相關基因表達水平的檢測結果，分析中草藥YLK中的活性成分可能通過直接的抗菌作用、增強單核細胞或中性粒細胞的吞噬功能、促進溶菌酶的分泌及活力、促進細胞因子的產生以及抗炎促消化等作用，提高牙鲆非特異性免疫功能，增強魚體對病原的防御力。然而，目前對于中草藥作用機理的深入研究不足，缺少完善的中草藥研篩技術體系，限制中草藥在水產養(yǎng)殖動物病害中的精準研發(fā)。大力開展中草藥活性成分功能分析以及中草藥與水產養(yǎng)殖動物機體間的相互作用機理研究，將有力推動中草藥在水產病害防治領域發(fā)展應用。

4 結論

中草藥作為中國傳統(tǒng)瑰寶，具有天然、高效、毒副作用小、抗藥性不顯著、資源豐富等優(yōu)點，兼有藥性和營養(yǎng)性，是替代抗生素解決目前水產養(yǎng)殖病害問題的有效途徑之一，已廣泛應用于水產病害防治領域。本研究根據中藥藥理作用，研制出一種中草藥復方免疫增強劑，通過投喂試驗發(fā)現其具有明顯的免疫增強效果，能顯著提高牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌感染能力，研究結果將為水產養(yǎng)殖中草藥防病技術研究提供重要參考。