傅小燕 黃濤 陳晴 何畏 黃曉秋 吳桂輝

據(jù)WHO[1]《2019年全球結(jié)核病報(bào)告》估算，2018年全球結(jié)核病新發(fā)患者例數(shù)為1000萬例，其中HIV陽性者86萬例，約占9%；在并發(fā)HIV感染者中，25萬例死于結(jié)核病。而我國作為全球30個(gè)結(jié)核病及結(jié)核病并發(fā)艾滋病的高負(fù)擔(dān)國家之一，形勢(shì)不容樂觀。據(jù)WHO[1]估計(jì)，2018年我國新增86.6萬例結(jié)核病患者，發(fā)病率為61/10萬；結(jié)核病并發(fā)艾滋病新增18 000例，其中死亡2400例。

文獻(xiàn)研究提示，與HIV陰性者相比，HIV陽性者患耐多藥結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)更高[2-3]，據(jù)WHO[4]第四次雙感患者耐藥監(jiān)測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示，全球范圍內(nèi)HIV陽性的結(jié)核病患者耐藥率為20%。我國結(jié)核病并發(fā)HIV感染患者的耐藥疫情亦十分嚴(yán)峻，相關(guān)研究提示，我國結(jié)核病并發(fā)HIV感染患者總體耐藥率為20%～45%，且存在地區(qū)差異性[5-6]。本研究回顧性分析2017年7月至2019年6月成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心結(jié)核科收治入院的結(jié)核病并發(fā)HIV感染的316例患者的結(jié)核分枝桿菌耐藥譜分布及耐藥基因突變特征，為臨床制訂合理的化療及患者耐藥管理方案提供參考。

資料和方法

一、研究對(duì)象

收集2017年7月1日至2019年6月30日成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心收治入院、經(jīng)BACTEC MGIT 960 分枝桿菌培養(yǎng)并鑒定為結(jié)核分枝桿菌，同時(shí)并發(fā)HIV感染的患者，共計(jì)316例；排除微孔板藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)結(jié)果數(shù)據(jù)及資料不全者53例，最終納入263例患者。其中男208例，女55例，年齡范圍 18～80歲，平均年齡(44.18±14.46)歲。

二、方法

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA) 檢測(cè) HIV-1抗體為陽性，經(jīng)蛋白免疫印跡試驗(yàn)(weastern blot，WB) 證實(shí)為HIV感染，試劑為HIV免疫印跡確認(rèn)試劑(上海英旻泰生物技術(shù)有限公司)。

采用MicroDSTTM微孔板藥敏檢測(cè)試劑盒(珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司)進(jìn)行12種一、二線抗結(jié)核藥品[異煙肼(INH)、利福平(RFP)、利福布汀(Rfb)、鏈霉素(Sm)、乙胺丁醇(EMB)、左氧氟沙星(Lfx)、莫西沙星(Mfx)、阿米卡星 (Am)、卷曲霉素(Cm)、利奈唑胺(Lzd)、丙硫異煙胺(Pto)、對(duì)氨基水楊酸(PAS)]的耐藥性檢測(cè)。步驟如下：在96孔板中每孔加入200 μl含菌的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基(除4個(gè)陰性對(duì)照孔)，蓋上盒蓋密封后置 37 ℃培養(yǎng) 7～14 d觀察結(jié)果。

采用結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒(DNA微陣列芯片法，北京博奧生物科技有限公司)檢測(cè)對(duì)RFP和INH耐藥的3個(gè)相關(guān)基因rpoB、katG及inhA基因的野生型及不同突變型耐藥基因突變。步驟如下：首先，將結(jié)核分枝桿菌的 DNA 從培養(yǎng)分離純化的菌株或直接從臨床樣品中提取出來; 對(duì)樣品中的靶基因進(jìn)行擴(kuò)增和熒光標(biāo)記，將擴(kuò)增并熒光標(biāo)記的基因序列與芯片上的探針進(jìn)行雜交反應(yīng); 最后，芯片掃描成像，用配套軟件進(jìn)行判讀。結(jié)果判讀：待測(cè)菌株某一基因所有檢測(cè)位點(diǎn)均為野生型則報(bào)告為野生型，即敏感；若待測(cè)菌株某一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)為突變型，則報(bào)告全部為突變型，即耐藥。

三、診斷標(biāo)準(zhǔn)與定義

1. 肺結(jié)核及肺外結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[7]。

2. 耐藥結(jié)核病診斷：參照《耐藥結(jié)核病化學(xué)治療指南(2015)》[8]。

3. HIV感染/AIDS診斷：參照《中國艾滋病診療指南(2018版)》[9]。

4. 初治與復(fù)治結(jié)核病定義：參照《WS 196—2017 結(jié)核病分類》[10]。(1)初治結(jié)核病患者指符合下列情況之一者：①從未因結(jié)核病應(yīng)用過抗結(jié)核藥品治療的患者；②正進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化療方案規(guī)則用藥而未滿療程的患者；③不規(guī)則化療未滿1個(gè)月的患者。(2)復(fù)治患者指符合下列情況之一：① 因結(jié)核病而不合理或不規(guī)則用抗結(jié)核藥品治療≥1個(gè)月的患者；②初治失敗和復(fù)發(fā)患者。

5. 耐藥結(jié)核病定義：(1)單耐藥結(jié)核病指僅對(duì)1種一線抗結(jié)核藥品耐藥；(2)耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)指至少對(duì)INH和RFP同時(shí)耐藥；(3)廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)指在耐多藥的基礎(chǔ)上至少同時(shí)對(duì)1種二線注射類和1種氟喹諾酮類抗結(jié)核藥品耐藥。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以“率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、263例結(jié)核病并發(fā)HIV感染者耐藥分布情況

263例結(jié)核病并發(fā)HIV感染者中，總的對(duì)抗結(jié)核藥品的耐藥順位依次如下：INH(14.8%,39/263)、RFP(11.0%,29/263)、Sm(8.4%, 22/263)、Mfx(6.5%, 17/263)、Rfb(6.1%,16/263)、Lfx(4.6%,12/263)、EMB(4.2%, 11/263)、Pto(3.4%, 9/263)、PAS(3.0%,8/263)。其中初治結(jié)核病并發(fā)HIV感染者耐藥順位如下：INH(7.9%,16/202)、Sm(5.4%,11/202)、RFP(5.0%,10/202)、Mfx(3.0%, 6/202)、Rfb(3.0%, 6/202)、EMB(2.5%,5/202)、Pto(2.0%, 4/202)、Lfx(1.5%,3/202)、PAS(1.5%, 3/202)。復(fù)治者耐藥順位如下：INH(37.7%, 23/61)、RFP(31.4%,19/61)、Sm(18.0%, 11/61)、Mfx(18.0%,11/61)、Rfb(16.4%, 10/61)、Lfx(14.8%,9/61)、EMB(9.8%, 6/61)、Pto(8.2%,5/61)、PAS(8.2%,5/61)。初復(fù)治患者均未發(fā)現(xiàn)對(duì)Am、Cm、Lzd耐藥菌株(表1)。

二、 結(jié)核病并發(fā)HIV感染患者結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變情況

263例結(jié)核病并發(fā)HIV感染患者中，通過DNA微陣列芯片法檢測(cè)出耐INH 35株，耐RFP 26株；對(duì)INH耐藥的基因突變順位依次為katG24株(68.6%)、inhA11株(31.4%)；對(duì)RFP耐藥的耐藥基因突變位點(diǎn)順位依次為rpoB531位點(diǎn)16株(61.5%)，rpoB526位點(diǎn)7株(26.9%)，rpoB516位點(diǎn)3株(11.5%)。

討 論

目前已證實(shí)HIV感染會(huì)增加患者感染耐藥結(jié)核分枝桿菌的風(fēng)險(xiǎn)[11]，與單純的HIV感染者相比，結(jié)核病并發(fā)HIV感染患者死亡率相對(duì)較高，并且大大縮短了患者的生存時(shí)間[12]。因此，探討結(jié)核病并發(fā)HIV感染具有重要的公共衛(wèi)生意義，對(duì)患者預(yù)后至關(guān)重要。

國外一項(xiàng)關(guān)于HIV感染和耐多藥結(jié)核病相關(guān)性的Meta分析中指出，在基于人群對(duì)照的研究中，HIV感染者發(fā)生耐多藥結(jié)核病的概率為24.0%[13]。本研究中，263例結(jié)核病并發(fā)HIV感染患者中，總體耐藥率為29.7%，與上述Meta分析結(jié)果總體相符。目前已證實(shí)對(duì)于HIV陰性的人群，復(fù)治結(jié)核病患者總耐藥率和耐多藥率均明顯高于初治患者[14]。本研究顯示，對(duì)于結(jié)核病并發(fā)HIV感染患者，復(fù)治者發(fā)生耐藥結(jié)核病的概率也較初治者明顯增加，整體上以一線抗結(jié)核藥品為主，其中對(duì)INH、RFP、Sm、Mfx、Lfx、Rfb的耐藥率均超過10%，對(duì)EMB、Pto及PAS的耐藥率相對(duì)較低。分析本研究中結(jié)核病并發(fā)HIV感染人群的高耐藥率結(jié)果，可能與以下原因有關(guān)：(1)藥物使用暴露量。應(yīng)加強(qiáng)對(duì)結(jié)核病并發(fā)HIV感染人群督導(dǎo)服藥管理及結(jié)核病的健康宣傳教育，減少不規(guī)律用藥，從而降低獲得性耐藥率。同時(shí)注意用藥過程中抗病毒和抗結(jié)核藥品之間的相互作用，避免誘導(dǎo)出現(xiàn)的繼發(fā)結(jié)核分枝桿菌耐藥。(2)HIV 感染易并發(fā)肺外結(jié)核，可能因抗結(jié)核治療療程不足而導(dǎo)致結(jié)核病復(fù)發(fā)，誘導(dǎo)耐藥的發(fā)生。

表1 一、二線抗結(jié)核藥品耐藥情況在結(jié)核病并發(fā)HIV感染者中的分布與比較

注a：初治患者與復(fù)治患者耐藥率比較

近年來，隨著氟喹諾酮類藥品在臨床的廣泛應(yīng)用，對(duì)Mfx及Lfx的耐藥率有上升趨勢(shì)。本研究中，對(duì)上述兩藥的總耐藥率達(dá)11.0%(29/263)。氟喹諾酮類藥品主要通過葡萄糖醛酸和硫酸鹽結(jié)合的細(xì)胞溶質(zhì)酶UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶和硫轉(zhuǎn)移酶代謝，與目前大多數(shù)抗病毒藥品無確切相互作用和(或)重疊毒性反應(yīng)。國外也曾報(bào)道在結(jié)核病并發(fā)HIV感染治療過程中，采用Mfx替代利福霉素也取得不錯(cuò)的治療效果[15]，故而臨床更易普及治療。加之其相對(duì)容易的獲取途徑和在其他呼吸系統(tǒng)疾病大量不規(guī)范的使用均會(huì)導(dǎo)致對(duì)氟喹諾酮類藥品耐藥率的升高。故而醫(yī)務(wù)人員應(yīng)重視監(jiān)管氟喹諾酮類藥品的臨床應(yīng)用，減少獲得性耐藥的發(fā)生，也是提高結(jié)核病并發(fā)HIV感染患者治愈率的有效手段之一。

本研究中，對(duì)RFP耐藥以rpoB531位點(diǎn)突變最為常見，其次為rpoB526及rpoB516位點(diǎn)突變；對(duì)INH耐藥以katG基因突變常見，其次為inhA基因突變。RFP通過與 RNA聚合酶β亞單位結(jié)合，干擾、抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而達(dá)到殺菌的效果；rpoB基因突變使RNA聚合酶高度保守的氨基酸發(fā)生置換，進(jìn)而阻止與RFP的結(jié)合而導(dǎo)致耐藥。突變一般發(fā)生在rpoB507～533位27個(gè)氨基酸密碼子組成的對(duì)RFP耐藥決定區(qū)內(nèi)。文獻(xiàn)報(bào)道，在HIV陰性的結(jié)核病人群中，最常見的突變位點(diǎn)是531位的絲氨酸(Ser)(40%～60%)、526位的組氨酸(His)(30%～36%)、516位的天冬氨酸(Asp)(7%～9%)[16]，其中rpoB531位點(diǎn)突變一般導(dǎo)致高水平耐藥。對(duì)INH的耐藥機(jī)制與katG、inhA和ahpC基因的啟動(dòng)子缺失或突變有關(guān)，其中katG完全缺失或點(diǎn)突變是最主要的耐藥機(jī)制[17]。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的HIV陰性的結(jié)核病耐藥基因分布總體相符[18-19]，但突變類型少于HIV陰性結(jié)核病人群，可能與本研究樣本量少有關(guān)；另一方面還可能與不同地區(qū)MTB耐藥的基因突變類型差異有關(guān)。

本研究為回顧性研究，尚未對(duì)比本院同期HIV陰性結(jié)核病患者耐藥基因譜分布情況，同時(shí)也未深入分析更多耐藥基因突變的差異。但可大體反映出成都地區(qū)結(jié)核病并發(fā)HIV感染患者耐藥譜及耐藥基因分布情況的變化?？紤]到結(jié)核病并發(fā)HIV感染者M(jìn)TB耐藥及耐藥基因突變與結(jié)核病總體人群相近，當(dāng)臨床難以獲得其具體耐藥結(jié)果時(shí)，抗結(jié)核用藥可適當(dāng)參考當(dāng)?shù)亟Y(jié)核病總體人群的耐藥參數(shù)，合理制定抗結(jié)核方案，對(duì)控制結(jié)核病并發(fā)HIV感染患者的預(yù)后具有重要作用。