全菲，楊勇

(中國藥科大學藥物科學研究院，江蘇 南京 211198)

細胞死亡對維持機體正常發(fā)育、內穩(wěn)態(tài)以及預防過度增生性疾病(如癌癥)等至關重要。調節(jié)性細胞死亡(regulated cell death,RCD)過程受專門的分子機制調節(jié)，因此可通過特定的藥理學方法或基因干預進行調控[1]。鐵死亡的發(fā)現源于小分子erastin對癌基因RAS突變的細胞具有致死選擇性，大量鐵依賴性脂質活性氧(reactive oxygen species,ROS)的致死性累積是其主要特征，可被鐵螯合劑去鐵胺(deferoxamine,DFO)和脂質ROS清除劑ferrostatin-1所抑制[2]。研究表明，除RAS外的其他致癌因素也與鐵死亡信號通路有關，此外部分經美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的抗癌藥物已鑒定為鐵死亡的誘導劑[3-12]，因此靶向鐵死亡成為一種有前景的癌癥治療策略。隨著對鐵死亡調節(jié)機制的深入探索，不同類型的鐵死亡誘導劑應運而生，為觸發(fā)癌細胞鐵死亡提供可行性。本文將闡述影響鐵死亡的主要代謝途徑，并綜述靶向癌細胞鐵死亡的研究進展。

1 鐵死亡調控機制

自2012年提出鐵死亡的概念以來[2]，大量研究顯示，其主要的調節(jié)機制和信號傳導途徑包括鐵離子的轉運以及脂質ROS的產生與清除，此外含鐵蛋白的分解、輔酶Q10(coenzyme Q10,CoQ10)的合成以及谷氨酰胺分解代謝也影響癌細胞對鐵死亡誘導劑的敏感性(見圖1)。

1.1 鐵代謝 鐵是人體正常生理活動所必需的，然而具有氧化還原活性的鐵離子可通過催化可溶性脂質自由基的形成，以酶促或非酶促的方式氧化不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)。一方面胞內不穩(wěn)定鐵池主要由Fe2+組成，Fe2+參與芬頓反應所產生的OH·是一種具有高度流動的水溶性ROS，可啟動脂質過氧化；另一方面鐵和鐵的衍生物如血紅素或鐵硫簇，也對產生ROS的酶如NADPH氧化酶(NADPH oxidases,NOXs)、脂氧合酶(lipoxygenase,LOXs)和線粒體電子傳遞鏈復合物的活性至關重要，因此細胞對鐵的攝入、儲存和利用可影響胞內有毒的游離鐵水平[13]。

胞外鐵可由血清中的轉鐵蛋白(transferrin,TF)通過相應受體TFR介導的內吞作用轉運至胞內。鐵調節(jié)蛋白(iron-regulatory proteins,IRPs)能精確感應胞內的鐵穩(wěn)態(tài)，在鐵離子濃度下降時與鐵反應元件(iron-responsive elements,IREs)結合，阻遏鐵蛋白(ferritin,FT)的合成。FT充當貯庫，儲存過量的鐵并在需要時動員游離鐵。雖然鐵轉運蛋白(ferroportin,FPN)是哺乳動物細胞唯一的鐵輸出蛋白，但近期研究表明，FT也可經外泌體轉運至胞外，釋放游離鐵。研究顯示，在多種癌細胞中發(fā)現FPN的下調和TFR1的上調，使癌細胞對鐵的需求高于非癌細胞，這種“鐵成癮”使癌細胞更易受鐵過載和ROS累積的影響[3，14-15]。

1.2 脂質代謝 PUFAs的豐度和位置決定了細胞中脂質過氧化的程度。脂質組學表明，含有花生四烯酸(arachidonic acid,AA)或腎上腺酸(adrenic acid,AdA)的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamines,PEs)是鐵死亡中發(fā)生過氧化反應的主要底物。長鏈脂酰輔酶A合成酶4(Acyl-CoA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)將AA或AdA活化為花生四烯酰-CoA和腎上腺酰-CoA，再由溶血磷脂酰膽堿?；D移酶3(lysophosphatidylcholine acyltransferase 3,LPCAT3)將這些衍生物酯化為PEs，形成AA-PE和AdA-PE并入膜磷脂，最后被LOXs氧化為脂質氫過氧化物，執(zhí)行鐵死亡[16]。

脂質過氧化物可能通過兩種機制對癌細胞產生毒性：分子水平上，脂質氫過氧化物可能分解為4-羥基-2-壬烯醛或丙二醛，破壞蛋白質；結構上，脂質的廣泛過氧化使生物膜變薄和曲率增加，并進一步氧化，最終形成膜孔和膠束[17]。

1.3 抗氧化代謝 作為細胞內重要的抗氧化劑，谷胱甘肽(glutathione,GSH)的水平影響脂質ROS的清除效率，而胞內半胱氨酸的耗竭，可導致GSH合成減少。氨基酸反向轉運系統Xc-由12次跨膜蛋白溶質載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)和跨膜調節(jié)蛋白SLC3A2通過二硫鍵鏈接而成，谷氨酸和胱氨酸以1∶1的比例在細胞膜兩側通過系統Xc-進行交換，鐵死亡小分子誘導劑erastin可抑制SLC7A11，減少細胞對胱氨酸的攝入[18]。除了利用系統Xc-外，部分癌細胞也可在胞外半胱氨酸缺乏的情況下，利用富余的蛋氨酸通過轉硫途徑(transsulfuration)合成半胱氨酸，因此這些細胞對系統Xc-抑制劑具有抗性[19]。Xc-下游的谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)是細胞膜的監(jiān)護員，輔助GSH將有毒的脂質氫過氧化物轉化為無毒的脂肪醇。GPX4對硒代半胱氨酸的利用賦予其出色的抗鐵死亡特性，硒代半胱氨酸活性部位的合成與甲羥戊酸途徑相關[20]。

胞外高濃度的谷氨酸能抑制系統Xc-對胱氨酸的攝入，雖然谷氨酰胺經分解能產生L-谷氨酸，但胞外高濃度的谷氨酰胺并不能誘導鐵死亡。有研究表明，抑制癌細胞對谷氨酰胺的攝入或谷氨酰胺的分解有助于抵抗鐵死亡，且僅與谷氨酰胺酶2(glutaminase 2,GLS2)相關[14]。另外，谷氨酰胺分解的代謝產物α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,αKG)也參與鐵死亡，盡管線粒體在鐵死亡中的作用存在爭議，但αKG回補三羧酸循環(huán)中的富馬酸酶是腎癌中重要的腫瘤抑制蛋白[21]。

除GSH-GPX4抗氧化系統外，新發(fā)現的鐵死亡誘導劑FIN56提出了鐵死亡發(fā)生的其他機制，FIN56同時耗竭GPX4和甲羥戊酸途徑產生的CoQ10，CoQ10是內源性的脂溶性抗氧化劑[22]。最近研究表明鐵死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1,FSP1)經過豆蔻?；揎棸邢蚣毎ぃ€原質膜CoQ10，以平行于GPX4的方式抑制脂質過氧化，是強效的鐵死亡抑制因子，也是多種癌細胞抗鐵死亡的生物標志物[23]。

核因子紅系2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)調節(jié)細胞抗氧化，是一種關鍵的抗鐵死亡轉錄因子，激活p62-Keap1-NRF2通路可抑制肝癌細胞發(fā)生鐵死亡。NRF2正向調控鐵穩(wěn)態(tài)相關基因如血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HMOX1)、FTH1、FPN，以及GSH合成相關基因如SLC7A11等[24-25]。最近發(fā)現的ferroptocide，是NRF2靶點之一硫氧還蛋白的抑制劑，可誘導多種癌細胞發(fā)生鐵死亡，屬于新型的鐵死亡誘導劑[26]。

2 (抑)癌基因與鐵死亡

(抑)癌基因與鐵死亡之間有著密切的聯系，這一方面證明了鐵死亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，另一方面也為誘導腫瘤細胞鐵死亡提供了更多的靶點。

2.1 p53 p53是人體重要的抑癌基因，幾乎在一般以上的人類腫瘤中可檢測到p53的突變或失活，其主要通過轉錄或翻譯后機制調節(jié)鐵死亡。在細胞應激狀態(tài)下，p53通過抑制SLC7A11的轉錄來抑制對胱氨酸的攝取，從而使細胞對鐵死亡更加敏感。p53乙?；毕菪屯蛔凅wp533KR顯著下調移植瘤中SLC7A11的蛋白和mRNA水平，野生型p53可被高水平的E3泛素-蛋白連接酶鼠雙微基因2(mouse double minute 2,MDM2)蛋白降解，設計能夠干擾或阻止p53-MDM2相互作用的親脂小分子已成為癌癥治療的重要目標[4]。p53促進亞精胺/精胺N1-乙?；D移酶1(spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1,SAT1)的轉錄，而人類腫瘤中SAT1發(fā)生下調，過表達SAT1可促進脂質過氧化誘導的鐵死亡，SAT1與花生四烯酸15脂氧合酶(arachidonate 15-lipoxygenase,ALOX15)的表達相關，但p53-SAT1--ALOX15具體機制仍不清楚[5]。在非應激和應激條件下，p53均可促進GLS2的轉錄，肝細胞癌中GLS2的表達顯著降低，過表達GLS2則顯著減少腫瘤細胞的集落形成，同時GSL2是一種新的小GTP酶Rac1蛋白的負調控因子，介導p53抑制腫瘤轉移的功能[6]。p53阻斷固醇調節(jié)元件結合蛋白-2(sterol regulatory element-binding protein-2,SREBP-2)的激活，而SREBF-2調控甲羥戊酸途徑，p53功能缺失突變會使甲羥戊酸途徑更加活躍，增加肝癌的患病風險[7]。

在一些癌細胞中p53是鐵死亡的負調控因子，erastin誘導人結直腸癌細胞發(fā)生鐵死亡的過程中，野生型p53可與核內的二肽基肽酶-4(dipeptidyl-peptidase-4,DPP4)結合促進SLC7A11的表達，而p53的缺失阻止DPP4的核聚積，使膜相關DPP4與NOX1結合觸發(fā)脂質過氧化[8]。p53通過調節(jié)CDKN1A(編碼p21)的轉錄，延緩了人纖維肉瘤細胞由胱氨酸缺乏所誘導的鐵死亡，MDM2抑制劑可增加p53的表達，阻斷由系統Xc-抑制劑所誘導的鐵死亡[9]。

2.2 BRCA1 腫瘤抑制因子BRCA1相關蛋白1(BRCA1 associated protein 1,BAP1)的核上調與腫瘤侵襲性相關。BAP1編碼一種核去泛素化酶，可減少染色質上組蛋白2A泛素化(H2Aub)，BAP1依賴去泛素化的方式減少SLC7A11啟動子上H2Aub的占有率，抑制SLC7A11的表達。BAP1功能缺失與腎透明細胞癌、眼部腫瘤、膽管癌、間皮瘤等癌癥的發(fā)生有關[10]。

2.3 RAS RAS是癌癥中最常見的突變癌基因，RAF激酶抑制劑索拉非尼(sorafenib)[27]在美國獲得FDA批準用于治療腎細胞癌，諸如erastin之類的鐵死亡誘導劑在致癌基因HRAS、KRAS或BRAF突變的人類腫瘤細胞中表現出更強的殺傷力。最近研究表明，高遷移率組蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)通過RAS-JNK/p38通路調節(jié)鐵死亡，是治療白血病的潛在藥物靶點[28]。這表明RAS-MAPK信號通路在介導腫瘤細胞鐵死亡的發(fā)生中具有重要地位，RAS下游信號分子的抑制劑或可能是重要的抗癌藥物。

3 鐵死亡誘導劑的抗癌效應

研究表明，部分小分子化合物和FDA已批準的藥物可誘導腫瘤細胞發(fā)生鐵死亡。系統Xc-和GPX4是開發(fā)鐵死亡誘導劑的重要靶標，干擾鐵代謝相關通路或借助納米材料直接向腫瘤細胞“輸送”鐵離子，也可增加腫瘤細胞對鐵死亡的敏感性。

3.1 系統Xc-抑制劑 Erastin是最早發(fā)現的系統Xc-抑制劑，能有效抑制小鼠體內卵巢腫瘤的生長[29]。有研究表明在現有的系統Xc-抑制劑中，erastin的類似物imidazole ketone erastin (IKE)是較為有效且代謝穩(wěn)定的鐵死亡誘導劑，有潛在的體內應用價值，能有效抑制彌漫性大B細胞淋巴瘤實驗模型中腫瘤的生長[30]。柳氮磺吡啶(sulfasalazine)是FDA批準用于治療某些類型關節(jié)炎的免疫抑制劑，也可有效抑制系統Xc-，與化療藥吉西他濱(gemcitabine)聯用可顯著抑制胰腺癌的生長[11]。直接抑制GSH形成的谷胱甘肽合成酶抑制劑丁硫氨酸-亞砜亞胺L-BSO可抑制小鼠乳腺腫瘤的生長[31]。

系統Xc-常作為聯合療法的紐帶，在卵巢癌和黑色素瘤模型中，免疫檢查點抑制劑與可特異性降解胞外胱氨酸和半胱氨酸的人工合成蛋白酶cyst-(e)inase聯用，能顯著增強T細胞介導的抗腫瘤免疫反應。其中免疫療法激活的CD8+T細胞通過分泌IFN-γ，抑制SLC7A11的表達，誘導腫瘤細胞發(fā)生鐵死亡。人類黑色素瘤臨床樣本也顯示，CD8+T細胞浸潤較高的腫瘤組織中，SLC7A11和SLC3A2表達水平較低[32]。免疫療法激活的CD8+T細胞和放療激活的腫瘤相關巨噬細胞所產生的IFNγ，相互獨立但協同抑制SLC7A11，免疫療法通過促進腫瘤細胞鐵死亡使腫瘤對放療更加敏感[33]。放療后接受手術切除的食道癌患者臨床樣本顯示，放療所誘導的鐵死亡伴隨著SLC7A11和GPX4的適應性上調，相應的鐵死亡誘導劑可減輕放療過程中癌細胞對鐵死亡產生的抗性[34]。鐵死亡在傳統治療方法與新興的免疫療法中都扮演著重要的角色，為聯合療法提供理論依據。

3.2 GPX4抑制劑 對177個癌細胞系的敏感性分析顯示，彌漫性大B細胞淋巴瘤和腎細胞癌對由GPX4調節(jié)的鐵死亡特別敏感。(1S,3R)-RSL3(RSL3)是發(fā)現的第一個GPX4抑制劑，與GPX4的親核活性位點硒代半胱氨酸共價作用，導致酶不可逆性失活，可抑制小鼠模型中纖維肉瘤的生長[35]。FDA批準的抗腫瘤藥物altretamine用于治療卵巢癌，可抑制GPX4誘導腫瘤細胞鐵死亡[12]。FIN56促進GPX4的降解，同時與角鯊烯合酶結合，降解CoQ10[22]。他汀類藥物通過抑制甲羥戊酸途徑的限速酶，抑制由p53突變所引起的甲羥戊酸途徑失控，從而減少硒蛋白GPX4以及CoQ10的合成，使細胞容易發(fā)生鐵死亡，這和服用他汀類藥物與多種癌癥死亡風險的降低有關[7]。

CoQ10上游FSP1的高表達與腫瘤對多種GPX4抑制劑，如RSL3、ML210和ML162的抗性相關。體內實驗表明，當GPX4失活時，FSP1可以在體內維持肺部腫瘤的生長。研究表明FSP1的表達水平可用于預測促鐵死亡藥物在癌癥中的有效性，并強調了FSP1抑制劑在克服癌細胞對鐵死亡耐藥性中的潛力[23]。FINO2通過使GPX4失活和氧化鐵，促進脂質過氧化，誘導癌細胞鐵死亡[22]。Withaferin A除了抑制GPX4，還通過HMOX1介導的血紅素降解，增加游離鐵，抑制神經母細胞瘤的生長并降低復發(fā)率[36]。

3.3 鐵過載 癌細胞對鐵的攝取增加或輸出減少都會使其胞內鐵離子濃度增加。溶酶體干擾劑sirameine和酪氨酸激酶抑制劑lapatinib 促進轉鐵蛋白表達升高，在24 h內協同誘導乳腺腫瘤細胞死亡[37]。BAY11-7085不依賴其作為IκBα抑制劑的功能，通過NRF2-SLC7A11-HMOX-1途徑，降解血紅素釋放游離鐵誘導癌細胞鐵死亡[38]。除了通過上述抑制劑調節(jié)鐵代謝相關通路富集鐵，也可外源性添加氯化鐵、血紅蛋白、氯化高鐵血紅素和硫酸亞鐵銨等直接增加胞內游離鐵，研究表明硫酸亞鐵銨或血紅素通過增加不穩(wěn)定的Fe2+觸發(fā)神經母細胞瘤鐵死亡[39]。

此外，由核受體共激活因子4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)調控的鐵自噬(ferritinophagy)可降解鐵蛋白,在小鼠胚胎成纖維細胞和人纖維肉瘤細胞中過表達NCOA4可增加鐵蛋白的降解[40]。乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞中高表達的prominin 2，促進包裹鐵蛋白的多泡小體和外泌體(exosomes)的形成，將鐵轉運至胞外[15]。自噬和外泌體相關信號分子在誘導細胞鐵死亡中的作用，也促使我們思考鐵死亡與其他RCD之間的交集。

3.4 納米藥物 借由納米材料調控腫瘤微環(huán)境中的鐵富集和ROS水平，開啟了腫瘤治療的“鐵器”時代。目前大部分納米藥物的設計基于向腫瘤細胞遞送Fe2+或Fe3+，參與芬頓反應誘發(fā)鐵死亡。Ferumoxytol是FDA批準用于臨床治療鐵缺乏癥的氧化鐵納米顆粒(iron oxide nanoparticles,IO NPs)，可抑制早期乳腺癌的生長[5]。IO NPs可設計為同時負載順鉑，一方面順鉑激活NOXs，促進ROS的產生，另一方面納米顆粒以內吞的方式進入細胞，逆轉細胞對順鉑的耐藥性[41]。脂質過氧化氫納米顆粒(lipid-hydroperoxide-tethered IO NPs)可適應腫瘤酸性微環(huán)境，產生活性單態(tài)氧用于癌癥治療[42]。將p53質粒封裝在金屬-有機網絡(metal-organic networks,MONs)中制備的MON-p53，可經鐵死亡和凋亡雙重途徑清除癌細胞，抑制腫瘤生長，并延長荷瘤小鼠壽命。由于具有促進細胞內氧化應激的能力，MON-p53可以減少腫瘤的血液轉移、肺轉移和肝轉移[43]。

4 展望

癌癥治療的挑戰(zhàn)之一在于如何在殺死癌細胞的同時，保持健康細胞的完好無損。癌細胞通常在細胞死亡執(zhí)行機制方面有所缺陷，這與癌細胞本身的代謝重編程和腫瘤微環(huán)境密切相關。癌細胞“鐵成癮”，而鐵代謝直接影響鐵死亡中脂質自由基的形成；癌細胞長期處于缺氧環(huán)境，而抗氧化代謝直接影響鐵死亡的執(zhí)行；以及癌基因突變與鐵死亡信號通路之間的聯系，這都提示我們從癌細胞獨特的代謝方式出發(fā)，尋找合適的鐵死亡誘導劑靶向腫瘤微環(huán)境，對癌癥治療過程中出現的耐藥性進行方案改進，并為聯合用藥提供理論依據。另外，鐵死亡介導免疫系統的抗腫瘤效應表明，靶向鐵死亡通路并聯合免疫檢查點抑制劑是未來頗具潛力的腫瘤治療策略。總之，探索鐵死亡調節(jié)機制和癌細胞代謝通路之間的交集，可為靶向鐵死亡的癌癥療法提供新的思路。