吳曉云，刁飛燕，李秀慧，劉春霖，李啟艷

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東 濟(jì)南 250101)

西洋參為五加科人參屬植物，是名貴的中藥材，人參皂苷是其主要活性成分，主要有人參皂苷Rg1、Rb1、Rb2、Rc、Rd和Re等。以西洋參為原料的保健食品具有緩解體力疲勞，增強(qiáng)免疫力、抗氧化和抗腫瘤等作用[1]。目前，西洋參類保健食品的劑型有硬膠囊、軟膠囊、片劑和口服溶液等，主要以總皂苷作為標(biāo)志性成分，總皂苷的測(cè)定主要采用香草醛-高氯酸或硫酸顯色后用紫外分光光度法測(cè)定[2]，該方法存在專屬性差，操作復(fù)雜和干擾因素多等缺點(diǎn)。

為此，徐燦輝等[3]改進(jìn)了西洋參類保健食品中人參皂苷測(cè)定方法，建立了西洋參類保健食品中7種參皂苷含量高效液相色譜(HPLC)測(cè)定的方法。此外，人參皂苷測(cè)定方法還有超高效液相色譜(UPLC)[4]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)[5-6]等。在眾多資料中，主要研究西洋參根莖葉提取物中人參皂苷含量，但對(duì)西洋參類保健食品中10種人參皂苷含量測(cè)定的報(bào)道較少。

本試驗(yàn)通過(guò)參考西洋參藥材中皂苷測(cè)定的有關(guān)文獻(xiàn)[7-9]，建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定多種劑型西洋參類保健食品中10種人參皂苷，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器 液相色譜儀(Agilent 1260 高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司)， 配二極管陣列檢測(cè)器(PAD)；電子天平(Mettler Toledo MS，梅特勒-托利多)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(北京永光明)。

1.2 試藥與供試品 乙腈(色譜純，Honeywell)；甲醇(色譜純，Honeywell)；超純水；正丁醇(分析純，國(guó)藥集團(tuán))；氨水(分析純，國(guó)藥集團(tuán))。

標(biāo)準(zhǔn)品：人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rg1、Rg3、Rd、Re由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供,含量分別為95.9%、93.8%、97.0%、96.3%、100%、94.4%、97.4%，人參皂苷Rg2、Rc、Rf由上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司提供，含量分別為98.02%、99.11%、99.62%。

供試品均由市場(chǎng)購(gòu)得，名稱與劑型見表1。

表1 12種供試品的名稱和劑型

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～40 min,17%A→19%A;40～60 min,19%A→29%A;60～75 min,29%A;75～100 min,29%A→40%A;100～105 min,40%A→17%A)；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液及對(duì)照品混合工作液配制 分別精密稱定人參皂苷Rg1、Rg2、Rg3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf對(duì)照品適量,置于25 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容,制成人參皂苷單體濃度分別為2.409、2.141、0.047 12、1.947、1.758、2.138、2.250、2.062、2.077、2.008 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取10種人參皂苷對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋制成6個(gè)濃度的混合對(duì)照品工作液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 片劑、膠囊劑供試品溶液的制備 片劑、膠囊劑，取內(nèi)容物研磨混勻后，片劑2 g，膠囊劑1 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，精密加水飽和正丁醇50 mL，密塞，放置過(guò)夜，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液20 mL，用氨試液洗滌兩次，每次20 mL，正丁醇提取液蒸干后，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，作為供試品溶液。

2.3.2 口服溶液供試品溶液的制備 口服溶液，精密量取8.0 mL供試品至分液漏斗中，用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次10 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次10 mL，正丁醇提取液蒸干后，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 分別取6個(gè)濃度的混合對(duì)照品工作液，進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，以對(duì)照品濃度X(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，對(duì)照品的峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。得到10種人參皂苷在相應(yīng)線性范圍內(nèi)均具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)都在0.99以上，結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的結(jié)果

2.5 試樣重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確量取6份口服溶液供試品(S01)8.0 mL至分液漏斗中，以下按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液。

準(zhǔn)確稱取6份膠囊劑供試品(S05)1 g，6份片劑供試品(S08)2 g，置于100 mL錐形瓶中，以下按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液。

分別取3種劑型供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，以保留時(shí)間定性，測(cè)定峰面積，計(jì)算供試品中10種人參皂苷的含量。3種劑型供試品中人參皂苷含量RSD(n=6)均小于3%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好，結(jié)果見表3。

2.6 系統(tǒng)適應(yīng)性考察 取10種人參皂苷混合對(duì)照品工作液10 μL進(jìn)樣，計(jì)算10種人參皂苷的理論板數(shù)。得到人參皂苷Rg3、Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的理論板數(shù)分別為103 427、50 732、104 490、157 284、120 457、82 876、253 440、260 991、410 628、239 554，分離度分別為5.4、1.6、32.6、15.1、2.2、4.0、4.8、1.6、8.0。對(duì)于供試品，雖然存在基質(zhì)干擾影響分離度，但是3種劑型供試品中10種人參皂苷均能達(dá)到基線分離，分離度均能達(dá)到1.5以上。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

注：“-”表示未檢出或低于定量限

2.7 精密度試驗(yàn) 取10種人參皂苷混合對(duì)照品工作液10 μL連續(xù)進(jìn)樣5次，以測(cè)得的峰面積響應(yīng)值作評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，得到10種人參皂苷的RSD(n=5)均小于3.0%，表明在本方法儀器條件下，儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取供試品S01、S05、S08，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，得到供試品溶液，室溫下放置24 h，分別在0、2、4、8、12、24 h取10 μL進(jìn)樣，得到10種人參皂苷峰面積RSD(n=6)都在3.0%以內(nèi)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確量取6份已知含量的供試品(S01)4.0 mL至分液漏斗中，分別精密加入人參皂苷對(duì)照品儲(chǔ)備液適量(對(duì)照品加入量與供試品中各人參皂苷含量之比為1∶1)，以下按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作，即可得到加標(biāo)溶液。

準(zhǔn)確稱取已知含量的供試品(S05)0.5 g，供試品(S08)1 g，各6份，分別精密加入人參皂苷對(duì)照品儲(chǔ)備液適量(對(duì)照品加入量與供試品中各人參皂苷含量之比為1∶1)，置于100 mL錐形瓶中，以下按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，即可得到加標(biāo)溶液。

取10 μL注入液相色譜儀，以保留時(shí)間定性，測(cè)定峰面積，得到10種人參皂苷的平均加樣回收率(n=6)，RSD均小于4.0%，結(jié)果見表4。

表4 回收率結(jié)果

注：“-”表示未檢出或低于定量限

2.10 檢出限與定量限 S/N=3時(shí)，得到檢出限LOD，人參皂苷Rg1、Rg2、Rg3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf檢出限分別為0.002 4、0.002 1、0.002 9、0.001 9、0.001 8、0.002 1、0.002 2、0.002 1、0.002 1、0.002 0 μg；S/N=10時(shí)，得到定量限LOQ，定量限分別為0.006 0、0.005 4、0.007 4、0.005 0、0.004 4、0.005 3、0.005 6、0.005 2、0.005 2、0.005 0 μg。

2.11 供試品的測(cè)定 取12批供試品，按照按“2.3” 制備供試品溶液，每批平行處理2份，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，將峰面積代入“2.4”線性回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果見圖1～2及表5。

表5 供試品中10種成分含量測(cè)定結(jié)果

注：“-”表示未檢出或低于定量限

3 討論

3.1 前處理考察 由于保健食品劑型種類多，而每種劑型的基質(zhì)比較復(fù)雜，導(dǎo)致10種人參皂苷更難同時(shí)分離。首先，通過(guò)比較3種不同的提取試劑，水飽和正丁醇、甲醇和乙醇，最終得到水飽和正丁醇提取效率最高。其次，選用水飽和正丁醇分別采用回流提取、液-液萃取、浸泡放置過(guò)夜超聲提取和直接超聲提取4種提取方式進(jìn)行比較，結(jié)果表明：對(duì)于片劑和膠囊劑，浸泡過(guò)夜超聲提取與回流提取得到皂苷含量最高，又因?yàn)榍罢卟僮骱?jiǎn)單，且提取的多糖等雜質(zhì)較少，最終采用浸泡過(guò)夜超聲提取；對(duì)于口服溶液，回流提取與液-液萃取都能得到較高總皂苷含量，優(yōu)先選取重現(xiàn)性好且操作較簡(jiǎn)單的處理方法，因此采用水飽和正丁醇振搖多次萃取。

3.2 流動(dòng)相及梯度的選擇 本文對(duì)甲醇-水，乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸溶液3種不同流動(dòng)相進(jìn)行比較，結(jié)果表明，人參皂苷在低波長(zhǎng)范圍內(nèi)檢測(cè)時(shí)，乙腈比甲醇背景噪音低，可獲得較好的分離效果，并且乙腈與水混合黏度小，可以有效降低系統(tǒng)壓力，而加入磷酸對(duì)整體分離情況沒(méi)有明顯改善且磷酸鹽對(duì)色譜柱損耗大，最終選擇乙腈-水作為最佳流動(dòng)相。

10種人參皂苷中Rg1和Re，Rb2和Rb3較難分離。人參皂苷Rg1和Re極性非常相似，較難分離，且供試品在人參皂苷Rg1和Re附近有雜質(zhì)干擾，最終選擇合適梯度，在45 min 左右達(dá)到基線分離。Rb2和Rb3是同分異構(gòu)體，并且兩者含量很低，容易包裹在雜質(zhì)峰中，本試驗(yàn)在保證峰形和柱效的前提下完成了兩種皂苷的基線分離。故最終采用梯度洗脫使每種皂苷達(dá)到較好分離效果。

3.3 樣品測(cè)定結(jié)果分析 由表5可見，12批供試品10種皂苷含量之和差異很大，含量最高的為硬膠囊，片劑和軟膠囊次之，口服溶液最低。每批供試品中，單種人參皂苷占10種皂苷比例各不相同，經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，Rb1、Rc、Rd、Re 4種所占比例最大，7批供試品含這4種皂苷比例為67.0%～88.5%，4批供試品的比例為39.0%～53.8%，1種供試品(S04)比例為0。對(duì)于供試品(S04)，根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)中規(guī)定的紫外分光光度法進(jìn)行總皂苷檢測(cè)，得到總皂苷含量為80 mg·100 mL-1。本文建立的HPLC-PAD法可對(duì)西洋參類保健食品中皂苷成分進(jìn)行初步鑒定，最終用紫外分光光度法進(jìn)行總皂苷檢測(cè)。

4 結(jié)論

本文共收集口服溶液、片劑和膠囊劑12批西洋參類保健食品，通過(guò)測(cè)定其線性范圍、系統(tǒng)適用性、重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性、檢出限、定量限和回收率試驗(yàn)，結(jié)果令人滿意。試驗(yàn)表明，在本文供試品制備方法和色譜條件下，人參皂苷Rg3、Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd能夠達(dá)到完全分離，所建立的方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好,可以用來(lái)對(duì)以西洋參為原料的保健食品進(jìn)行質(zhì)量控制。